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第一部分：吸入一氧化氮对新生大鼠肺发育的影响目的：观察吸入高浓度NO和低浓度NO对新生大鼠肺泡化的影响；吸入高浓度NO和低浓度NO对新生大鼠肺血管发育的影响；以探讨吸入NO对新生大鼠肺发育的影响。方法：①吸入NO动物模型的建立：新生大鼠在出生第一时间被置于50x50x70cm3的树脂玻璃箱内,吸入NO组大鼠玻璃箱连接一氧化氮来源,对照组大鼠玻璃箱连接空气。吸入方式为实验组大鼠出生后持续吸入浓度为5ppm NO或浓度为20ppm NO,对照组大鼠吸入室内空气,吸入时间为7天。为防止NO2潜在的副作用,NO/NO2浓度检测仪检测,NO2浓度被控制在1ppm以下。一部分实验大鼠在出生后第7天被处死；一部分实验大鼠在出生后第14天被处死,这部分实验大鼠出生前7天吸入不同浓度的NO,以后的7天吸入室内空气。②实验动物分组：30只实验大鼠随机分为4个实验组和2个对照组,每组5只。4个实验组为：NO5-7组,吸入NO5ppm7天,出生后第7天被处死；N020.7组,吸入NO20ppm7天,出生后第7天被处死；NO5-14组,吸入NO5ppm7天第14天被处死组；NO20-14组,吸入NO20ppm7天第14天被处死组。2个对照组为：C7组,吸入室内空气7天,出生后第7天被处死对照组；C14组,吸入室内空气14天,出生后第14天被处死对照组。③剖杀实验大鼠时称取各组大鼠体重,肺重,计算肺重／体重的比值。④应用HE染色观察各组大鼠肺形态学变化,包括放射性肺泡计数和平均线形截距。⑤采用CD34作为血管内皮细胞的标记物,应用免疫组化检测各组大鼠肺CD34的表达,血管密度计数参照Kunig等报道的方法。计数每高背视野下CD34染色阳性血管,计算肺血管的密度。⑥所得数据输入计算机,用SPSS10.0软件进行统计学分析。结果：①与对照组相比,吸入NO组大鼠体重,肺重,以及肺重／体重的比值差异无显著性。②放射性肺泡计数：N020.7组与C7组相比,明显增加(9.3±1.2vs7.9±2.9,P<0.05)。其余各实验组与对照组相比差异无显著性。③平均线形截距：N020.7组与C7组相比,明显降低(54.9μm±0.5μm vs60.μm±4.5μm,P<0.05)。其余各实验组与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。④大鼠肺血管密度：N05.7组与C7组相比,明显增加(13.2±5.4vs9.5±3.3,P<0.05)；NO20-7组与C7组相比,明显增加(13.7±4.7vs9.5±3.3,P<0.05)；其余各实验组与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。结论：本实验结果表明：①与对照组相比,N020.7组大鼠放射性肺泡计数明显增加,平均线形截距明显降低表明：吸入高浓度NO能促进新生大鼠早期肺泡的发育。②NO5-7组大鼠与N020-7组大鼠血管密度显著高于C7组大鼠,表明高浓度和低浓度吸入NO均能促进新生大鼠肺血管的发育。③低浓度吸入NO仅能促进新生大鼠早期肺血管发育,高浓度吸入NO即能促进新生大鼠早期肺血管的发育,也能促进肺泡的发育。④N020-14组大鼠和N05-14组大鼠与对照组相比,在放射性肺泡计数,平均线形截距,大鼠肺血管密度等方面差异均无显著性。吸入NO7天后大鼠肺血管密度和肺泡化增加,但第14天时吸入NO组与对照组大鼠肺血管密度并无差别,表明吸入NO能加速新生大鼠早期肺血管和肺泡的发育和成熟,我们推测这也与大鼠肺发育主要集中在出生后第一周有关。本实验为吸入NO促进新生大鼠肺发育提供了形态学依据；并为进一步研究吸入NO促进肺发育的机制提供了实验基础；为吸入NO预防和治疗BPD提供了有力的证据；也为吸入NO治疗和预防BPD作用机制的研究提供实验基础。第二部分：吸入一氧化氮对新生大鼠肺VEGE,FLK-1表达的影响目的：观察吸入高浓度NO和低浓度NO对新生大鼠肺VEGF,FLK-1表达的影响,探讨吸入NO促进肺发育的分子机制。方法：①实验动物动物模型的建立和实验动物分组同第一部分。②应用免疫组化检测实验大鼠肺血管内皮细胞,气道上皮细胞VEGF, FLK-1的表达。③应用Western blotting检测实验大鼠肺组织VEGF, FLK-1的表达。④ELISA定量检测实验大鼠肺组织VEGF浓度。⑤计算机图像分析等方法,测量相关的免疫组化染色强度的变化；测定Western blotting各显色条带的光密度值的变化。⑥所得数据输入计算机,用SPSS10.0软件进行统计学分析。结果：①吸入NO对新生大鼠肺内VEGF表达的影响：免疫组化检测显示实验组和对照组大鼠肺血管内皮细胞和气道上皮细胞均对VEGF呈阳性表达,同对照组比较,NO20-7组大鼠VEGF染色强度有显著性增强(P<0.05)。Western blot半定量检测和ELISA定量检测结果均证实了N020-7组大鼠肺组织VEGF表达较对照组显著增加。其余各实验组与对照组相比差异无显著性(P>0.05)②吸入NO对新生大鼠肺内FLK-1表达的影响：免疫组化检测显示实验组和对照组大鼠肺血管内皮细胞和气道上皮细胞均对FLK-1呈阳性表达,同对照组比较,NO5-7组大鼠FLK-1染色强度显著增强(P<0.05)；N020-7组大鼠FLK-1染色强度显著增强(P<0.05)。Westernblot结果证实了NO5-7大鼠肺FLK-1表达较对照组显著增加；N020-7组大鼠肺FLK-1表达较对照组显著增加。其余各实验组与对照组相比差异无显著性(P>0.05)结论：本实验结果表明：①首次发现吸入高浓度的NO能刺激新生大鼠肺VEGF和FLK-1的表达,结合第一部分形态学观察结果,我们可以认为吸入高浓度NO通过增加VEGF和FLK-1的表达促进新生大鼠肺血管的生长和发育,同时也促进新生大鼠肺泡的发育。②首次发现吸入低浓度NO都能增加新生大鼠肺内FLK-1的表达,结合第一部分形态学观察结果,我们可以认为吸入低浓度NO通过增加FLK-1的表达促进新生大鼠肺血管的生长和发育。③吸入低浓度NO仅能增加新生大鼠肺内FLK-1的表达,吸入高浓度NO增加新生大鼠肺内VEGF和FLK-1的表达。接合形态学观察结果：吸入低浓度NO能促进新生大鼠肺血管发育,吸入高浓度NO能促进新生大鼠肺泡和肺血管的发育。我们推测VEGF在肺发育过程中不仅能作用于肺血管内皮细胞,促进肺血管的发育,继而促进肺泡的发育,还可能直接作用于肺泡上皮细胞,直接促进肺泡的发育。其具体调节机制还不清楚,需进一步研究。④于第14天剖杀的大鼠,肺VEGF和FLK-1的表达与对照组相比均无显著性差异,这于我们实验第一部分的观察结果相一致。本实验在观察到吸入NO能增加新生大鼠肺微血管密度,促进肺血管的发育的基础上,从对肺血管发育有关键调控作用的生长因子VEGF/VEGFR2入手,进一步探讨吸入NO促进肺发育的分子机制。我们首次发现吸入高浓度NO上调VEGF和FLK-1的表达,吸入低浓度NO上调FLK-1的表达,深入地明确了吸入NO促进肺发育的分子机制,为吸入NO治疗和预防BPD提供了有力的理论支持。第三部分吸入一氧化氮上调新生大鼠肺VEGF表达的分子途径探讨目的：观察吸入NO对新生大鼠HIF-1α, HO-1, eNOS表达的影响,探讨吸入NO上调VEGF表达的分子调控机制。方法：①实验动物动物模型的建立同第一部分。②实验动物分组：本部分仅对出生后第7天剖杀的大鼠进行实验研究。共3个组：C7组、NO5-7组、NO20-7组。③应用免疫组化检测实验大鼠肺血管内皮细胞,气道上皮细胞eNOS的表达。④应用Western blot检测实验大鼠肺内HIF-1α, eNOS的表达。⑥应用ELISA定量检测实验大鼠肺组织HO-1的浓度。⑥计算机图像分析等方法,测量相关的免疫组化染色强度的变化；测定Western blot各显色条带的光密度值的变化。⑦所得数据输入计算机,用SPSS10.0软件进行统计学分析。结果：①吸入NO对实验大鼠肺内HIF-1α表达的影响：Western blot结果显示,N020-7组大鼠和NO5-7组大鼠肺内HIF-1α蛋白表达与对照组相比无差异(P>0.05)。②吸入NO对实验大鼠肺内HO-1表达的影响：ELISA结果显示,与对照组相比,N020-7组大鼠肺组织HO-1浓度显著增高(P<0.05)；NO5-7组大鼠肺组织HO-1浓度无差异(P>0.05)。③吸入NO对实验大鼠肺内eNOS表达的影响：免疫组化检测显示实验组和对照组大鼠肺血管内皮细胞和气道上皮细胞均对eNOS呈阳性表达,同对照组比较,N020-7组大鼠肺内eNOS染色强度显著减弱(P<0.05); Western blot结果证实了N020-7组大鼠肺内eNOS蛋白表达较对照组显著降低(P<0.05)。免疫组化和Western blot结果均显示NO5-7组大鼠肺内eNOS蛋白表达与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。结论：本实验结果表明：①新生大鼠吸入高浓度NO诱导VEGF合成增加由HO-1调节。②HIF-1α对新生大鼠吸入高浓度NO诱导VEGF合成增加无调节作用。③吸入高浓度NO抑制;NOS的表达,吸入高浓度NO诱导VEGF合成增加并非通过VEGF-NO信号通路增加eNOS表达,产生内源性NO,由内源性NO正反馈增加VEGF的合成。④吸入高浓度NO抑制eNOS的表达,作用机制不明确,需进一步探讨。本实验第一次阐明吸入NO上调VEGF表达的分子途径,吸入NO上调VEGF蛋白表达通过HO一1调节。