[背景]随着全球经济的发展,人们生活水平的普遍提高,糖尿病发病随之增高,已成为严重危害人类健康的慢性非传染性疾病,对个人、家庭和社会造成了巨大的经济负担。早期预防、早期干预以减少糖尿病的发病率无疑是解决此类问题最理想的办法。而这有赖于对糖尿病发病机制的深入了解。胰岛素抵抗和胰岛功能障碍是糖尿病发病机制的两个关键环节。理解糖尿病胰岛功能障碍的病理生理机制,对于深入了解糖尿病的发生发展过程,有效地预防、诊断和治疗糖尿病具有重要意义。随着分子生物学技术的发展,对参与β细胞增殖、凋亡及分泌功能分子信号机制有了较深入的了解,有可能为疾病的治疗提供新的靶点,从而提高糖尿病治疗的准确性和成功率。胰高血糖素样肽(Glucagon Like Peptide-1, GLP-1)受体激动剂等药物的开发利用更是为糖尿病分子靶点治疗带来了新的希望,目前其人工合成的制剂已经广泛应用于糖尿病的临床治疗。作为一种激素样多肽GLP-1能与胃抑多肽共同组成了肠促胰岛素(incretin),餐时从肠道分泌,加强β细胞对葡萄糖刺激引起的胰岛素分泌。GLP-1还促进胰岛素作用于周围组织(肌肉、脂肪、肝脏等)摄取葡萄糖。抑制胰高血糖素分泌,诱导饱感,促进胰岛新生β细胞分化及增殖。GLP-1生物学效应主要依赖于其GLP-1受体作用,GLP-1受体属于G蛋白耦联受体一员,该类受体在代谢组织器官的功能调控中发挥了重要的作用,故称之为代谢性受体。研究表明,对p细胞增殖及功能的调节常常依赖于代谢物、激素及细胞因子等作用, G蛋白耦联受体是上述调节物质的作用靶点之一与GLP-1相似,甲状旁腺素相关蛋白(Parathyroid hormone-related protein, PTHrP)属于一种激素样蛋白,其受体甲状旁腺素受体1(Type 1 receptor parathyroid hormone-related protein, PTH1R)同样属于G蛋白耦联受体的一员。近年来PTHrP及PTH1R作为一个调控胰岛功能作用的相关靶点逐渐受到关注。流行病学研究提示,在糖尿病等患者血清中PTHrP明显增高。胰岛的4种内分泌细胞(α、β、δ、pp细胞)均可表达PTHrP。同时,PTH1R作为β细胞上PTHrP的作用受体,被认为在β细胞中研究PTH1R可能比PTHrP更具有代表性。PTH1R受体后的信号通路激活与细胞增殖相关,在既往多种组织及细胞中已经得到证实。而且有研究发现PTH1R激活后的的信号传导与胰岛素分泌存在交叉作用。高血糖能诱导β细胞凋亡及损伤β细胞功能。其中,这种糖毒性的机制主要依赖于多种的转录因子水平的调节。包括胰腺十二指肠同源因子盒基因-1(Pancreatic Duodenal homeobox-1, PDX-1)、神经源性分化蛋白(Neurogenic Differentiation, NeuroD)及葡萄糖转移蛋白-2(Glucose transporter-2, GLUT-2)等,其中G蛋白耦联受体是上述调控因子启动靶点之一。由此推测认为G蛋白耦联受体PTH1R,可能同时参与调控胰岛β细胞增殖及分泌过程,在糖尿病中PTH1R表达,为保护性因子或是致病性因子仍待阐明,我们将对此进行初步探讨。本课题以大鼠胰岛细胞瘤细胞株INS-1为研究靶细胞,以高糖状态为研究的切入点,探讨细胞因子PTH1R与胰岛p细胞功能的关系及PTH1R介导其功能的可能机制。以期为糖尿病的防治提供更多的理论支持。具体研究内容分为三章。第一章甲状旁腺素受体1基因沉默INS-1细胞模型的构建及鉴定[目的]通过构建小RNA干扰PTH1R基因的载体并鉴定后,转染INS-1细胞,检测其转染率,建立甲状旁腺素受体1基因沉默的INS-1细胞模型,为阐明PTH1R在高糖状态下INS-1作用机制研究提供技术保证。[方法]1.在线寻找合适的PTH1R干扰靶点,筛选出三个阳性基因序列及一个阴性基因序列合成干扰片段后用于实验。2.建立PTH1R干扰载体：将合成寡脱氧核苷酸退火,进行pSUPERretro-GFP/Neo载体的酶切,退火形成的DNA双链与双酶切载体按一定比例进行连接,将连接产物转化到DH5a感受态中菌落PCR,初步筛选出阳性基因序列,并进行测序,最终确定阳性基因序列。利用Lipofectamine2000转染INS-1细胞。3.采用Realtime-PCR及Western blotting法同时检测PTH1R mRNA及蛋白的表达,计数法检测培养转染细胞率。4.统计学处理：实验数据均采用各组的均值±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件包行单因素方差分析(One-Way ANOVA),进一步多重比较采用LSD法。检验标准为α=0.05。[结果]1. PTH1R阳性基因序列筛选及鉴定：在线寻找合适的PTH1R基因干扰靶点,合成,退火形成双链DNA与经双酶切pSUPERretro-GFP/Neo连接。菌落PCR,初步筛选出阳性基因序列,并进行测序,最终确定阳性基因序列均与理论预期相符。2.小RNA干扰PTH1R基因转染INS-1细胞：利用Lipofectamine2000转染pSUPERretro-GFP/Neo-小RNA干扰PTH1R载体进入INS-1细胞,荧光显微镜下均可见绿色荧光,检测三个阳性基因序列及一个阴性基因序列的转染率提示48h转染率最高。Realtime-PCR及Western blotting证明INS-1细胞整合有小干扰RNA的PTH1R。[结论]成功构建出大鼠甲状旁腺激素受体1基因沉默的INS-1细胞模型第二章高糖状态下甲状旁腺素受体1对INS-1细胞功能的影响[目的]为检测PTH1R对高浓度葡萄糖状态下INS-1细胞胰岛素合成分泌功能的影响,通过观察不同条件下INS-1细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)能力及细胞内胰岛素含量的情况及GLUT-2表达进行阐明。[方法]1.根据文献采用25mmol/L葡萄糖浓度状态下对小RNA干扰PTH1R阳性基因序列组(SiPTH1R)、阴性基因序列组(SiPTH1R-NC)、空载组及对照组INS-1细胞进行观察,放射免疫法检测葡萄糖刺激细胞胰岛素分泌能力及胞内胰岛素含量。2.应用Realtime PCR及Western blotting检测高糖(25mmol/L葡萄糖)状态下对照组、SiPTH1R-NC组及PTHrP干预组(20nmol/LPTHrP)及SiPTH1R组中GLUT-2 mRNA和蛋白表达。3.统计学处理：实验数据均采用各组的均值±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件包行单因素方差分析(One-Way ANOVA),进一步多重比较采用LSD法。检验标准为α=0.05。[结果]1.高糖状态下PTH1R基因沉默与INS-1细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌能力的关系：在高糖状态下,PTH1R基因沉默显著降低细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌能力,比较对照组、空载组及SiPTH1R-NC组分别下降了24.1%(P<0.05)、30.84%(P<0.01)及25.26%(P<0.05)。2.高糖状态下PTH1R基因沉默对INS-1细胞内胰岛素含量：PTH1R基因沉默后INS-1细胞胰岛素含量与对照组、空载组及SiPTH1R-NC组间无统计学差异(P>0.05)。3. PTH1R对INS-1细胞GLUT-2表达的影响：在高糖状态下,比较对照组、SiPTH1R-NC及PTHrP干预组,PTH1R基因沉默后GLUT-2 mRNA及蛋白表达显著下调,PTHrP干预组GLUT-2 mRNA及蛋白表达高于空白对照组及SiPTH1R-NC组(P<0.01)。[结论]1. PTH1R基因沉默抑制高糖状态下INS-1细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌能力,但不影响细胞内胰岛素含量。提示PTH1R可能是维系高糖状态下INS-1细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌能力关键调控因子。2. PTH1R被PTHrP激活后GLUT-2 mRNA及蛋白表达水平上调,提示PTH1R介导的INS-1细胞胰岛素分泌功能改变与GLUT-2表达水平有关。第三章高糖状态下甲状旁腺素受体1对INS-1细胞存活能力的影响[目的]为检测PTH1R对高浓度葡萄糖状态下INS-1细胞存活能力的影响,通过观察INS-1细胞中生长活性、凋亡率、细胞周期、各种凋亡及增殖因子表达。同时检测NeuroD在不同条件下表达水平的变化进行阐明。[方法]1.根据文献采用25mmol/L葡萄糖浓度状态下对小RNA干扰PTH1R阳性基因序列组(SiPTH1R)、阴性基因序列组(SiPTH1R-NC)、空载组及对照组INS-1细胞进行观察,利用MTT方法检测细胞增殖情况,AnnexinV检测INS-1细胞凋亡情况,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学检测促凋亡蛋白Bad及抗凋亡蛋白Bcl-2表达。2.应用Realtime PCR及Western blotting检测高糖(25mmol/L葡萄糖)状态下对照组、SiPTH1R-NC组及PTHrP干预组(20nmol/LPTHrP)及SiPTHIR组中NeuroD mRNA和蛋白表达。3.统计学处理：实验数据均采用各组的均值±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件包行单因素方差分析(One-Way ANOVA),进一步多重比较采用LSD法。检验标准为α=0.05。[结果]1.高糖状态下PTH1R基因沉默影响INS-1细胞活性：与对照组、空载组及SiPTH1R-NC组比较,PTH1R基因沉默48h,分别使其细胞活性减少了22.11%(P<0.01)、18.90%(P<0.01),29.88%(P<0.01)。2.高糖状态下PTH1R基因沉默对INS-1细胞凋亡率的影响：在高糖状态下PTH1R基因沉默后细胞凋亡率为19.57±1.18%。显著高于对照组、空载组及SiPTH1R-NC组(P<0.01)。3.高糖状态下PTH1R基因沉默对INS-1细胞周期的影响：与对照组、空载组及SiPTH1R-NC组对比,在高糖状态下,PTH1R基因沉默后可抑制INS-1细胞从G0／G1期进入S期(P<0.01)。4.高糖状态下PTH1R基因沉默对INS-1细胞Bad及Bcl-2表达的影响：在高糖状态下,PTH1R基因沉默后INS-1细胞Bad表达显著上调,而Bcl-2表达下调,与对照组、空载组及SiPTH1R-NC组对比,差异有统计学意义(P<0.01)。5. PTH1R对INS-1细胞NeuroD表达的影响：在高糖状态下,与对照组、SiPTH1R-NC及PTHrP干预组比较,PTH1R基因沉默后显著下调NeuroD mRNA及蛋白的表达(P<0.01),而PTHrP干预组与对照组及SiPTH1R-NC组间差异无统计学意义。[结论]1. PTH1R基因沉默抑制高糖状态下INS-1细胞活性、促进细胞凋亡。提示PTH1R可能是高糖状态下INS-1细胞的生存因子之一。2. PTHIR基因可能是维系NeuroD表达重要因素,PTHIR基因低表达参与高糖状态下INS-1细胞凋亡的机制可能与NeuroD表达有关。