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腐败梭菌（Clostridium septicum）在土壤等自然界环境中分布十分广泛,是造成动物和人类恶性水肿病的主要病原体。该细菌感染羊后主要引发羊快疫,发病羊在2-3天内迅速死亡,给我国畜牧行业带来重大损失。因此,迫切需要建立一种针对羊快疫等腐败梭菌病的早期诊断方法,以做到对临床可疑发病样品的快速筛查。腐败梭菌最主要毒力因子为α毒素,该毒素具有溶血、致死和坏死等多种生物学活性,因此本研究以α毒素为主要研究对象,通过制备α毒素单克隆抗体及多克隆抗体,完成对双抗体夹心ELISA（Double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA）检测方法的初步探索,为羊快疫等腐败梭菌病的早期临床诊断提供技术支持。研究内容可分为以下三个部分:1、腐败梭菌天然α毒素与重组毒素蛋白的制备将腐败梭菌参考株（ATCC 12464）进行菌种复苏和增菌培养后,粗提腐败梭菌天然蛋白,使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）对提纯后的蛋白进行验证,获得大小为46 kDa的天然α毒素。根据NCBI上公布的腐败梭菌α毒素的CDs区序列,扩增α毒素基因,构建腐败梭菌α毒素原核表达系统,并在最佳诱导条件下(菌液OD600nm为0.4-0.6时,向菌液中加入浓度为0.5 mmol/mL的IPTG,37℃条件下诱导表达5 h)大量表达可溶性重组蛋白并纯化,最终测得目的蛋白浓度为4.28 mg/mL。通过Western blot分析表明该蛋白具有良好的免疫原性,证明腐败梭菌α毒素原核表达系统构建成功。2、单克隆抗体及多克隆抗体的制备使用灭活后的重组α毒素蛋白免疫新西兰大白兔,将获得的阳性血清利用抗原亲和层析方法进行纯化,获得纯化后的多克隆抗体浓度为0.98 mg/mL,多克隆抗体对重组蛋白效价检测结果为1:256000,对天然α毒素效价检测结果为1:128000,通过SDS-PAGE及Western-blot检测结果发现该多克隆抗体纯度高,特异性良好。使用灭活后的重组α毒素蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠血清转阳后制备脾细胞并进行细胞融合,通过杂交瘤细胞筛选及亚克隆实验,最终确定8株强阳性细胞株。通过稳定性检测发现有6株细胞可以稳定分泌单克隆抗体,其中3E8、6B12和6F10细胞株对天然α毒素的识别能力较强。选取其中的两株细胞3E8和6B12,分别腹腔注射免疫BALB/c小鼠,收集腹水并纯化后,通过间接ELISA测得两株单抗对重组蛋白效价检测结果为1:256000,对天然α毒素效价检测结果为1:128000,两株单抗浓度分别为2.27mg/mL和1.96 mg/mL,通过SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定单抗纯度及特异性,结果发现制备的两株单克隆抗体纯度高,特异性良好。3、针对腐败梭菌α毒素DAS-ELISA的初步建立为建立高效、灵敏的DAS-ELISA方法,探索最佳配对抗体及抗体工作浓度,本研究将多克隆抗体作为捕获抗体,将单抗3E8和6B12分别作为检测抗体,通过方阵滴定实验,确定作为捕获抗体的多克隆抗体的最佳工作浓度为1.25μg/mL,作为检测抗体的单抗3E8的最佳工作浓度为0.5μg/mL。在优化条件下验证该方法的特异性,结果表明该方法仅对腐败梭菌重组α毒素和天然α毒素具有识别作用,与其他蛋白无交叉反应,特异性良好。本研究成功构建了腐败梭菌α毒素重组蛋白的原核表达系统,在最佳诱导条件下大量诱导表达可溶性的目的蛋白,并以α毒素重组蛋白为基础,成功制备出针对腐败梭菌α毒素的特异性强,稳定性好的单克隆抗体及多克隆抗体。初步摸索出DAS-ELISA的最佳配对抗体及最佳抗体工作浓度,并验证了优化后的DAS-ELISA的特异性。为家畜腐败梭菌病的临床诊断提供了技术方法,也为腐败梭菌病疫苗和相关药物的研发提供了技术支撑。