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微生物细胞作为生物催化剂，有时需要应用于水/有机两相生物催化体系中以提高底物/产物的溶解性并降低其对细胞的抑制作用。然而，有机溶剂对绝大多数微生物细胞具有毒性。本研究以大肠杆菌为模型菌株，利用全局转录机制工程提高其对有机溶剂的耐受性。通过对全局转录因子σ70的编码基因rpoD进行随机突变构建突变文库，结合高通量筛选，最终获得两株σ70优良突变株C9和B1，分别能使大肠杆菌E. coli JM109耐受69%（v/v）环己烷和1.2%（v/v）丁醇。利用二维电泳，在不同有机溶剂条件下比较突变株C9总蛋白表达差异量性，发现有204个蛋白表达量差异在两倍以上，选取了其中43个高丰度蛋白进行MALDI-TOF/TOF分析，成功鉴定了22个蛋白。其中19个蛋白质的表达量上调，涉及核酸代谢、氨基酸代谢、糖代谢、能量代谢、转运蛋白以及外孔膜蛋白。3个蛋白质的表达量下调，分别为二肽结合蛋白、过氧化物酶以及外孔膜蛋白C。为验证这些蛋白对大肠杆菌有机溶剂耐受性的影响，选取了其中的6个蛋白（下调蛋白：二肽载体、过氧化物酶；上调蛋白：3-磷酸甘油醛脱氢酶、琥珀酸脱氢酶铁硫亚基、氨肽酶、假定蛋白YFGM）。在大肠杆菌中将以上6个蛋白的编码基因（dppA、bcp、gapA、sdhB、pepB、yfgM）进行敲除，并对上调基因（gapA、sdhB、pepB、yfgM）进行回补表达。溶剂耐受性试验表明，上调基因gapA、sdhB、pepB能够显著提高E. coli JM109对环己烷的耐受性。其中，3-磷酸甘油醛脱氢酶参与糖酵解过程，生成丙酮酸和ATP；琥珀酸脱氢酶铁硫亚基参与TCA循环，为琥珀酸脱氢酶提供辅酶，产生ATP；这两个蛋白表达量的上调可提高机体ATP能量水平，有利于微生物细胞克服有机溶剂的毒害作用。氨肽酶B蛋白对于提高有机溶剂耐受性的作用机制尚有待研究。经验证下调基因dppA的敲除明显提高了大肠杆菌对环己烷的耐受性，推测原因为该基因编码的蛋白与有机溶剂运输至胞内有关。此外，将本研究前期从Pseudomonas putida JUCT1鉴定获得的有机溶剂耐受性关键基因mmsB（编码3-羟基异丁酸脱氢酶），采用Red同源重组法整合到E. coli JM109的基因组。研究表明：携带了mmsB基因的E. coli JM109(DE3)(ΔendA::mmsB)对多种有机溶剂的耐受性均有显著提高，特别是毒性较高的乙酸丁酯和丁醇。将重组羰基还原酶表达质粒pET-kmCR转化宿主菌E. coli JM109(DE3)(ΔendA::mmsB)，成功实现了该重组菌在水相/乙酸丁酯（1:1）两相体系中不对称还原合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯[(R)-HPBE]，转化率较对照菌株E. coli JM109(DE3)/pET-kmCR提高近一倍。本研究为基因工程构建具有优良有机溶剂耐受性的微生物菌株提供了基础和实验依据，对于生物催化和生物能源等重要工业应用领域具有重要意义。