驼背鲈趋化因子CC25-like的克隆、鉴定及抗菌作用研究

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驼背鲈(Cromileptes altivelis)是我国重要的海水养殖鱼类,随着其养殖规模的扩大,病害问题日益严重。CC趋化因子是一类能促进免疫细胞迁移的小细胞因子,其在鱼类免疫中发挥重要的作用。本研究通过分子克隆技术获得了驼背鲈趋化因子CC25-like(CaCC25-like)基因序列,并对其抗细菌感染的作用进行了分析研究。结果如下:序列分析的结果显示,CaCC25-like的开放阅读框(ORF)全长为291 bp,共编码96个氨基酸,主要包括一段由20个氨基酸组成的信号肽序列和一个SCY结构域。同源序列比对的结果表明,CaCC25-like与其他硬骨鱼CC25有较高的同源性,为42.45%-97.92%,其中与褐带石斑鱼(Epinephelus bruneus)的同源性最高,为97.92%;CaCC25-like与哺乳动物CC25的同源性较低,不超过25%。系统进化树的结果显示,CaCC25-like属于CCL19/21/25亚组。为了探讨CaCC25-like的功能,本研究通过q RT-PCR技术对其转录水平的表达进行了分析,结果发现,CaCC25-like在健康的驼背鲈的9个组织中均有表达,其中在肝脏、血液、心脏和肠中表达量较高,随后是在脾脏、头肾、脑和鳃中表达量较低,在胃中表达量最低。在哈维氏弧菌感染驼背鲈后,CaCC25-like在脾和肾中表达量均显著上调。为了探讨CaCC25-like在体外的功能活性,本研究构建了其原核重组表达质粒p ET32a/CaCC25-like,表达并纯化了重组蛋白CaCC25-like(r CaCC25-like)。体外实验结果表明,当头肾淋巴细胞(HKLs)与r CaCC25-like孵育后,r CaCC25-like可以显著诱导淋巴细胞的迁移及其细胞增殖的作用且呈现剂量依赖的趋势;体外抑菌实验的结果表明,r CaCC25-like能显著抑制无乳链球菌、哈维氏弧菌和大肠杆菌的生长,表明r CaCC25-like具有一定的抗菌作用,可能在机体的抗细菌免疫中发挥作用。为了进一步探讨CaCC25-like的抗菌作用,本研究构建并合成了CaCC25-like的过量表达载体和干扰表达si RNA。体内实验结果表明,在鱼体内过量表达CaCC25-like后,哈维氏弧菌的感染量在肝、脾、肾组织中显著降低;与此一致的是,当干扰CaCC25-like的表达时,哈维氏弧菌的感染量在肝、脾、肾组织中显著增加。综上所述,CaCC25-like是一种功能性的趋化因子,具有募集淋巴细胞,促进细胞增殖和增强宿主免疫防御的功能,并且其能在驼背鲈抗细菌感染中发挥重要的作用。
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