青钱柳中含有多种活性成分,是一种很好的保健食品资源,但由于其资源匮乏且繁殖困难,严重制约青钱柳资源的开发利用。本文选用青钱柳叶片为外植体进行愈伤组织诱导,采用目视法及二分法筛选获得了高产三萜酸的细胞系,建立了稳定的青钱柳细胞悬浮培养体系,在此基础上采用搅拌式生物反应器进行扩大培养,对接种量、桨叶搅拌转速及通气量等重要参数进行了优化,并研究了扩大培养过程中的营养物质的消耗规律,以期为工业化培养青钱柳细胞生产三萜酸类活性物质提供理论支持。结果如下:以青钱柳叶片为外植体进行愈伤组织诱导,并择优进行继代培养,研究了细胞的生长规律和三萜酸积累规律。(1)不同青钱柳叶片外植体所诱导的愈伤组织在生长状态及三萜酸含量方面存在显著差异,通过筛选可获得高产三萜酸愈伤系;(2)继代次数对愈伤组织生物量及三萜酸积累有较大的影响,当继代到第10代左右,其生长量及三萜酸含量基本趋于稳定;(3)初步筛选获得9个优良的愈伤系,进一步对其生长量、三萜酸含量和产量进行了系统筛查,发现6号愈伤系生产性能最好,其三萜酸含量为2.55 mg/g。研究了5L搅拌式生物反应器的溶氧性能。通过对通气量、搅拌速率、温度、桨叶安装位置及桨叶组合对氧传质系数KLa的影响的系统试验,发现上述五个参数对KLa均有较大影响,其中通气量、搅拌速度和不同桨叶组合影响极显著,培养温度及桨叶安装位置影响显著。当通气量为1000 ml/min,搅拌速度为200 rpm,温度为35℃,安装高度H=8cm,桨叶在组合为2FDI时,氧传质系数KLa均达到最大值,分别为7.32、7.20、6.48、6.36、5.82 h-1。优化了搅拌式生物反应器扩大培养青钱柳悬浮细胞的主要工艺参数。优化培养条件如下:培养温度28℃,pH5.8±0.2,接种量5%,转速80rpm,通气量800 ml/min。优化培养条件下,细胞的鲜重、干重、总三萜酸含量及总三萜酸产量均达到最大值分别为275.16 g/L、12.99g/L、4.64 mg/g和60.21mg/L。研究了生物反应器扩大培养时的营养物质消耗规律。(1)总糖浓度逐渐减少,至培养结束总糖浓度为4.6 g/L;(2)0-4d蔗糖浓度迅速减少,8d后浓度仅为2.72 g/L,16d后随着蔗糖被消耗,细胞干重下降,三萜酸产量的积累速度增加;(3)0-4d还原糖浓度大幅度增加,最高浓度达到37.64 g/L,细胞干重增加,三萜酸产量积累减少;之后还原糖浓度直线下降,三萜酸产量急剧上升,细胞干重达到最大值,至培养结束还原糖浓度基本消耗完全;(4)8-16d硝酸根离子浓度迅速下降,细胞干重在16d达到最大,至培养结束硝酸根离子残留浓度为15.84 mmol/L,是初始浓度的40.41%;(5)铵根离子和磷酸根离子的浓度呈下降趋势,16d后基本消耗完全,细胞干重随之下降。