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尿路感染是指病原体侵犯尿路粘膜或组织引起的细菌感染性疾病,目前发病率仅次于呼吸道感染。雪荔组方是南京鼓楼医院的临床经验用方,经过二十多年的临床应用,确证该组方具有显著的抗炎和促进尿液排泄的作用,临床治疗尿路感染疗效确切。该组方由荔枝草、六月雪、车前草和紫花地丁四味中药构成。本文在已有研究的基础上,继续对雪荔组方总黄酮部位进行以下四个方面的研究:①测定雪荔组方总黄酮部位(TFCSP)的总黄酮含量并且建立HPLC指纹图谱,为其提取工艺质量控制提供依据;②研究雪荔组方总黄酮胶囊的制剂工艺并建立一般质量标准;③研究雪荔组方总黄酮部位对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应的作用,研究其对炎性介质和细胞因子分泌及基因表达的影响;④研究雪荔组方总黄酮部位对巨噬细胞炎症信号通路的作用,阐明总黄酮发挥抗炎作用的主要信号通路。1雪荔组方总黄酮部位提取工艺质量控制研究以芦丁为对照品,建立紫外分光光度法,测定10批样品中总黄酮的含量,10批样品中总黄酮平均含量是57.25%,RSD为1.21%。采用HPLC法研究雪荔组方总黄酮部位的指纹图谱,确定了 12个共有峰,并且对10批样品进行相似度评价,10批样品的相似度均大于0.95。2雪荔组方胶囊的制备及质量标准的建立优选雪荔组方胶囊的最佳辅料与制剂成型工艺。以辅料的种类、内容物的吸湿性、休止角和乙醇的浓度为考察指标,确定制备工艺。确定微晶纤维素为优选辅料,选用1号胶囊,每粒胶囊装填0.24g颗粒。对雪荔组方胶囊的质量标准进行了初步研究,采用HPLC法以高车前苷、高车前素为指标,对其体外溶出度进行考察。其中水分、装量差异、溶出度均符合药典规定,药物在60 min内体外溶出达90%左右。胶囊中高车前苷的溶出趋向于weibull分布模型、高车前素的溶出趋向于Higuchi方程。3雪荔组方总黄酮部位对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应的作用本实验以小鼠RAW264.7巨噬细胞作为探讨基础,利用LPS刺激,建立体外细胞炎症模型。首先通过MTT法检测不同浓度的TFCSP溶液对细胞活力的影响,随后研究TFCSP对巨噬细胞分泌产生的炎症介质和细胞因子(NO、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10)的影响,并用PCR检测TFCSP对炎症介质和细胞因子相关基因(iNOS、TNF-α、、IL-6、IL-1β、IL-10)表达的影响。结果表明,当药物浓度≤80μg·mL-1时对RAW264.7巨噬细胞生长无影响。TFCSP对LPS诱导的细胞炎症具有显著的抑制作用,且能显著降低炎症介质和炎性细胞因子(NO、TNF-α、IL-6、IL-1β)的分泌量以及下调相关基因的表达,且具有浓度依赖性。另外TFCSP能显著增加抗炎细胞因子IL-10的分泌及其基因表达进而发挥抗炎作用。4雪荔组方总黄酮部位对巨噬细胞炎症信号通路的作用初步明确TFCSP的抗炎作用后,为了进一步研究TFCSP对LPS诱导的炎症反应的作用机制,我们采用Western-blot检测了 TFCSP对LPS诱导的巨噬细胞内细胞信号通路(NF-κB、MAPKs、PI3K/AKT)的影响。当RAW264.7巨噬细胞受到LPS刺激后,细胞中p65、IκB-α、JNK、p38、AKT蛋白的磷酸化水平显著上调,即LPS能诱导这些信号通路的激活。TFCSP给药组能显著抑制p65、IκB-α、JNK、p38、AKT蛋白的磷酸化水平,抑制这些信号通路的激活,并呈现一定的浓度依赖性关系。此外,TFCSP高剂量组能显著上调IκB-α蛋白的表达。综上所述,本实验先通过测定总黄酮含量和建立HPLC指纹图谱对雪荔组方总黄酮部位的提取工艺进行质量控制,并且确定了雪荔组方胶囊的制备工艺和质量标准,该胶囊的制备工艺较大限度地保留复方中的活性成分,且具有较好的操作性,所拟定的质量标准可较好地应用于制剂质量的控制。该研究为复方中药的新药研发提供了基础资料。然后通过脂多糖(LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞构建体外炎症模型,分别运用ELISA、PCR和Western-blot法对TFCSP的抗炎作用及其机制进行了研究,结果表明TFCSP可能是通过阻断被LPS激活的NF-κB、MAPKs和PI3K/AKT信号转导通路,进而调控炎症介质和细胞因子相关基因的表达,最终影响炎症介质和细胞因子的分泌量进而发挥抗炎作用。