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禽传染性支气管炎(IB)呈世界广泛流行,是危害养鸡生产最严重的病毒性传染病之一,造成了严重的经济损失。核蛋白(N蛋白)和膜蛋白(M蛋白)是禽传染性支气管炎病毒(IBV)组成重要的结构蛋白,在IBV的复制和装配中起重要作用。酵母双杂交技术和免疫共沉淀系统能提供蛋白间作用依赖的细胞内环境,是分析鉴定病毒已知蛋白与蛋白相互作用及调控的工具。蛋白与蛋白相互作用在病毒生命过程中发挥着极其重要的作用,发现和验证在IBV中相互作用的结构蛋白是认识它们生物学功能的第一步。运用酵母双杂交技术研究IBVN蛋白和M蛋白在酵母中相互作用。采用PCR技术,以表达IBV SAIBk株(GENEBANK注册号AY302742)结构蛋白基因N、M真核表达质粒pIBVM、pIBVN为模板,克隆M基因序列与N基因序列,将该序列分别克隆到酵母双杂交载体质粒上,构建出重组质粒PGADT7-M和PGBKT7-N,经酶切分析、PCR鉴定和DNA测序证实连接片段的正确性后,采用醋酸锂法共转化酵母菌AH109,依次将阳性转化子挑到SD/-Trp/-Leu/-His固体培养基、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade固体培养基上生长,同时用β-半乳糖苷酶活性检测。结果表明N和M蛋白在酵母细胞内结合,启动His、Ade基因报告基因的表达,使AH109能够在SD/Ade-/His-/Leu-/Tpr-营养缺陷培养基上生长。同时激活LacZ基因,合成β-半乳糖苷酶。将转化pGBKT7-N的酵母AH109细胞和转化pGADT7-M的酵母AH109细胞分别涂布在SD/-His/-Trp和SD/-Ade/Trp平板上,不能生长,排除了pGBKT7-N和pGADT7-M自激活宿主菌。说明构建成功的pGBKT7-N和pGADT7-M能够适用于酵母双杂交系统进行蛋白相互作用的验证。本研究证明IBV的N蛋白和M蛋白在酵母细胞AH109体内能够结合,取得初步的阶段性研究成果,为下一步研究这两种结构蛋白的具体结合位点提供基础材料。进一步采用免疫共沉淀技术(Co-IP)验证N结构蛋白和M结构蛋白的相互作用。将N基因和M基因亚克隆到真核表达载体pCMV-HA和pCMV-Myc,共转染哺乳细胞HEK293,以pCMV-HA和pCMV-Myc空质粒为阴性对照。多克隆抗体HA为一抗,沉淀目的蛋白,进行SDS-PAGE,结果显示共转染重组质粒pCMV-HA-N和pCMV-Myc-M的细胞裂解液,出现两条非特异性条带,分别为抗体的重链和轻链,在轻链和重链之间可见两条目的蛋白条带,说明重组质粒pCMV-HA-N和重组质粒pCMV-Myc-M在细胞内表达了目的融合蛋白。共转染空质粒的阴性对照,在轻链和重链之间未见条带。用单克隆抗体Myc进行WesternBlotting,结果共转pCMV-HA-N和pCMV-Myc-M的样品中检测到M蛋白的表达,证实外源表达的IBV N蛋白和M蛋白在细胞HEK293中有特异性的相互作用。确认这两种结构蛋白的互作关系,对于从分子水平研究IBV的复制机制具有重要意义。