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1前言术后滤过泡瘢痕增生是青光眼滤过手术失败的主要原因之一。滤过手术后,结膜下创口的愈合过程是首先发生炎症反应,之后再上皮化,接着合成细胞外基质(ECM)和收缩结膜创口,最后形成结膜下纤维瘢痕。瘢痕的形成主要来自于创口部位的结膜下组织的过度收缩。多项研究表明,创口区域的人Tenon’s囊成纤维细胞(HTFs)与结膜下瘢痕形成息息相关。HTFs细胞外基质的增殖、迁移、合成和沉积等生物活性在瘢痕形成和滤过通道的阻塞中扮演了关键角色。结膜下滤过泡的伤口愈合反应由各种细胞因子如转化生长因子-β1(TGF-β1)调节。目前,TGF-β1己经成为抗纤维化治疗的重要靶点。孟鲁司特是半胱氨酸白三烯受体1(CysLT1R)的选择性拮抗剂,药理作用是通过阻止半胱氨酸白三烯(CysLT)介导的支气管收缩、血管通透性的增加,和气道炎症细胞聚集来实现的。然而,孟鲁司特抗纤维化的性能在之前较少被关注,仅有极少数研究表明其可以抑制支气管上皮细胞间质转化和纤维化,并抑制成纤维细胞中基质金属蛋白酶和胶原蛋白的产生。2目的研究孟鲁司特对TGF-β1诱导的原代培养的人Tenon’s囊成纤维细胞细胞外基质(ECM)重塑的影响。3方法3.1细胞分离,培养和处理收集10个行斜视手术的患者的结膜下组织,提取分离出Tenon’s囊成纤维细胞。所有细胞均于含有10%胎牛血清,1%L-谷氨酰胺和1%抗生素(青霉素和链霉素)的DMEM培养基中,37℃、95%空气、5%CO2恒温环境中培养。实验采用的为传至3-6代的HTFs.3.2.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)根据说明书,使用Qiazol试剂从培养的HTFs中提取出总细胞内RNA。将之逆转录成为cDNA。检测CysLT1RmRNA在HTFs中的表达。3.3胶原凝胶收缩测定制备游离胶原蛋白混合物。将0.5ml游离胶原蛋白加入到24孔细胞培养板中。待混合物凝胶化后,将胶原凝胶自培养板孔分离。然后将0.5ml含有TGF-β1和不同浓度孟鲁司特的无血清DMEM加入到每个凝胶孵育。每天测量凝胶的直径以计算凝胶收缩的程度。3.4蛋白印迹分析使用细胞裂解液及EDTA游离蛋白酶抑制剂的混合物来提取经TGF-β 1及不同浓度孟鲁司特干预过的HTFs的总蛋白。然后检测CysLT1R、MMP-1、MMP-3、FAK、paxillin、p-FAK,p-paxillin 和 α-SMA 蛋白含量。3.5免疫荧光显微镜免疫荧光检测CysLT1R在细胞中的定位情况。3.6纤连蛋白和Ⅰ型前胶原C肽的测定用ELISA法测定培养基中的前胶原Ⅰ型纤维连接蛋白和C肽含量。3.7统计分析实验数据以均数±标准差(x±s)表示。使用Tukey-Kramer检验进行统计学分析,P<0.05被认为具有统计学意义。4结果4.1 CysLT1R在HTFs中的表达以人类A431细胞作为阳性对照,RT-PCR结果表明CysLT1R确实在HTFs中表达。通过蛋白质印迹分析(Western bolt)验证HTFs中CysLT1R的蛋白表达。同样的,免疫荧光染色实验显示CysLT1R在HTFs中表达。4.2 TGF-β1 增加 HTFs 中 CysLT1R 的表达接下来,我们研究经TGF-β1干预后CysLT1R的表达模式。我们发现TGF-β1的干预导致CysLT1R的mRNA和蛋白质含量随TGF-β1浓度从0.5至5ng/n1的的增加而持续增长。这表明CysLT1R可能与TGF-β1在HTFs的功能相关。4.3孟鲁司特对TGF-β1诱导的HTFs胶原凝胶收缩的影响孟鲁司特是CysLT1R的选择性拮抗剂。将HTFs与浓度为0,1,10,50μM的孟鲁司特及TGF-β1(0,2.5 ng/ml)干预的情况下共同孵育3天。结果显示孟鲁司特随着浓度的增加逐步改善TGF-β1诱导的凝胶收缩。当孟鲁司特浓度为1,10或50μM时,2.5 ng/ml的TGF-β1对胶原凝胶收缩的刺激作用分别被抑制30%,48%,或55%。将HTFs与浓度0,50μM的孟鲁司特和2.5ng/mlTGF-β1共同孵育5日,发现随着时间推移,孟鲁司特逐步抑制TGF-β1诱导的胶原凝胶收缩。4.4孟鲁司特对MMPs表达和基质合成的影响细胞介导的胶原收缩是由基质金属蛋白酶(MMPs)诱导的。因此,我们评估了孟鲁司特对MMPs表达的影响。Western blot结果显示TGF-β1的干预使MMP-1和MMP-3的表达显著增加,而孟鲁司特以剂量依赖的方式抑制该效应。除了改善基质收缩之外,抑制MMP可以减少基质产生。接下来,我们研究孟鲁司特对MMPs表达的抑制作用是否影响基质的产生。通过使用特定的ELISA法来确定来自HTFs的纤连蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的释放。TGF-β1诱导的纤连蛋白释放和胶原Ⅰ型C末端前肽的分泌增加被孟鲁司特以浓度依赖的方式抑制。4.5孟鲁司特对基质收缩相关蛋白FAK和桩蛋白的磷酸化及α-SMA表达的影响。细胞介导的胶原收缩基质是非常复杂的。粘着斑激酶(FAK)和桩蛋白(paxillin)的磷酸化和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的激活参与了该过程。因此,我们接下来研究了孟鲁司特是否会影响HTFs中FAK和paxillin的磷酸化和α-SMA 的表达。TGF-β1(2.5ng/mL)诱导了 HTF 中 FAK 和 paxillin 的磷酸化,并被孟鲁司特以浓度依赖性方式抑制。然而,FAK和桩蛋白的总量不受TGF-β1或孟鲁司特的影响。Western blot结果显示TGF-β1或孟鲁司特均未影响α-SMA的表达。5结论5.1 CysLT1R 在 HTFs 中表达。5.2 CysLT1R在HTFs中的表达随TGF-β1浓度升高而升高。5.3 TGF-β1诱导MMP-1和MMP-3表达增加及HTFs分泌纤连蛋白和Ⅰ型胶原增加,孟鲁司特抑制了该效应,减轻了细胞基质的收缩和沉积。5.4孟鲁司特能减弱TGF-β1诱导的FAK和桩蛋白的磷酸化,从而减轻的成纤维细胞介导的细胞外基质收缩。5.5孟鲁司特可能是滤过手术后结膜下创口愈合期间抑制瘢痕形成的有效药物。