【摘 要】
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目的: Nell-1是一个与颅缝早闭相关的新型分泌蛋白。作为一个可能的生长因子,与骨软骨世系有高度特异性,在包括啮齿类和其他大型动物的多种机体模型中对骨发育有全面的诱导作
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目的: Nell-1是一个与颅缝早闭相关的新型分泌蛋白。作为一个可能的生长因子,与骨软骨世系有高度特异性,在包括啮齿类和其他大型动物的多种机体模型中对骨发育有全面的诱导作用。本实验通过观察钛片上前成骨细胞MC3T3-E1的生长状态,研究不同浓度Nell-1对前成骨细胞增殖、分化及成骨的影响,并从中筛选出最佳浓度;探讨其可能机制是否通过激活MAPK/ERK信号通路。 方法: ⑴将前成骨细胞MC3T3-E1接种于钛片,体外进行复合培养,采用扫描电镜观察前成骨细胞的生长情况。将实验分成5个组,即4个Nell-1实验组(1ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、500 ng/ml)和空白对照组(未加Nell-1组)。CCK8法检测Nell-1对前成骨细胞增殖活力的影响;ALP活性试剂盒检测ALP的活性;ELISA法检测OCN的分泌水平;Western-Blot法检测RUNX2、OPG和COL-1的蛋白表达情况;qRT-PCR法检测ALP、OCN、RUNX2、OPG、COL-I和OSX的基因表达情况。筛选Nell-1促成骨分化的最佳浓度。⑵Western-Blot法观察Nell-1对前成骨细胞在钛片表面ERK、JNK和P38的蛋白磷酸化水平。采用通路抑制剂U0126抑制ERK信号通路。ELISA法检测OCN的分泌水平;Western-Blot法检测ERK的蛋白磷酸化水平以及RUNX2和OPG的蛋白表达情况;qRT-PCR法检测OCN、RUNX2、OPG和OSX的基因表达情况。 结果: ①扫描电镜观察见前成骨细胞在钛片表面生长良好。②Nell-1实验组的增殖活力基本低于对照组(P<0.05)。③Nell-1促进前成骨细胞在钛片表面的ALP活性,上调了OCN、RUNX2、COL-I和OPG的蛋白表达水平以及ALP、OCN、RUNX2、COL-I、OPG和OSX的基因表达水平(P<0.05)。其中Nell-1浓度为100ng/ml时成骨分化效果最佳。④在MAPK通路中,Nell-1在钛片表面促进前成骨细胞ERK和JNK的蛋白磷酸化水平(P<0.05),对P38的蛋白磷酸化水平无明显影响(P>0.05)。⑤ERK抑制剂U0126下调了Nell-1对前成骨细胞在钛片表面OCN、RUNX2和OPG的蛋白表达水平以及OCN、RUNX2、OPG和OSX的基因表达水平(P<0.05)。 结论: ⑴Nell-1抑制前成骨细胞的增殖,但能有效促进前成骨细胞在钛片表面成骨分化的作用,且浓度为100ng/ml的作用效果最佳。⑵在MAPK通路中,Nell-1对前成骨细胞在钛片表面激活了ERK通路和JNK通路,但未明显激活P38通路。⑶Nell-1可能通过激活MAPK/ERK信号通路促进前成骨细胞在钛片表面的成骨分化作用。
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