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作为免疫效应分子的重要组成部分,抗菌肽在先天免疫过程中发挥着不可或缺的作用。烟草甲Lasioderma serricorne是世界性仓储害虫,对多种储藏物造成毁灭性危害。象虫金小蜂Anisopteromalus calandrae是烟草甲的优势寄生蜂。本研究基于象虫金小蜂寄生烟草甲后,利用转录组测序筛选并克隆了4个抗菌肽基因（LsAtt2、LsCole、LsDef1和LsDef2）,研究其先天免疫功能以及在寄生模式下的免疫响应模式,对研究象虫金小蜂寄生烟草甲的寄生机制和抗菌肽的开发利用具有重要意义。1、烟草甲被象虫金小蜂寄生后的转录组测序及免疫相关基因的筛选通过Illumina Hiseq TM4000高通量测序技术,获取象虫金小蜂寄生6、24 h后烟草甲高龄幼虫差异表达基因,深入挖掘与寄生免疫相关的基因。转录组测序共获得398.01 Mb clean reads,进一步拼接后,产生123,820个Unigene。其中81,600、25,234、67,820、62,249、51,155、62,806和62,911个Unigene分别注释于Nr、Nt、KEGG、Pram、GO、KOG和Swiss-Prot数据库。将Unigene进行同源比对发现,烟草甲的Unigene与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的同源性最高（17.91%）,与赤拟谷盗Tribolium castaneum的同源性较高（15.45%）。将所获得Unigene进行GO富集分析,发现51,155个Unigene分别注释到GO数据库中的3个大类58个功能组。KEGG富集分析显示,烟草甲转录组中67,820个Unigene得以注释。进一步筛选出与烟草甲免疫识别、信号转导与调控和效应分子共51类1,133个基因。聚焦寄生6、24 h后烟草甲转录表达水平显著上调的Attacin（1个）和Defense（2个）基因,及显著下调的Coleoptericin（1个）基因。2、烟草甲4个抗菌肽基因的克隆及序列分析利用RT-PCR技术克隆获得烟草甲4个抗菌肽基因（LsAtt2、LsCole、LsDef1、LsDef2）的ORF全长序列,长度分别为507 bp、354 bp、261 bp和273 bp,分别编码167、117、86和90个氨基酸,预测蛋白分子量分别为18.37 k Da、12.99 k Da、9.40 k Da和9.48 k Da,理论等电点分别为9.12、8.24、5.39和5.49。4个抗菌肽基因均在N端存在信号肽区域,在C端分别存在抗菌肽各家族保守的结构域。4个抗菌肽预测氨基酸均为亲水性氨基酸,且存在较多的预测磷酸化位点,分布也比较均匀。LsDef1和LsDef2编码蛋白在第38位和第29位氨基酸存在糖基化位点。系统发育分析表明,烟草甲4个抗菌肽基因分别与各自家族的基因聚为一支,且与鞘翅目昆虫的抗菌肽形成较为独立的分支。其中,烟草甲LsCole与双叉犀金龟Trypoxylus dichotomus的Td Cole C亲缘关系高达58%;LsAtt2与赤拟谷盗Tribolium castaneum的Tc Att氨基酸序列一致性高达87%;烟草甲2个防御素LsDef1和LsDef2聚为一支,亲缘关系为57%。3、抗菌肽基因的时空表达和菌液诱导下表达模式分析利用qPCR技术检测烟草甲4个抗菌肽基因的时空表达模式和菌液诱导下表达模式,结果显示4个抗菌肽基因在烟草甲所检测的发育阶段和组织部位均有不同程度的表达。LsAtt2在高龄幼虫和蛹期的表达量较高,LsCole、LsDef1和LsDef2均在高龄幼虫期表达量最高。LsAtt2在中肠的表达最高,为脑的14.1倍,LsDef1和LsDef2分别在中肠和表皮中表达较高,LsCole在脑的表达量显著高于其他组织。菌液诱导结果表明,LsAtt2和LsCole对大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus胁迫在各时间点均有显著表达,LsDef1和LsDef2在各时间点均不受E.coli诱导表达,仅对S.aureu诱导有响应,分别在12 h和24 h达到最高,为对照的7.1和8.9倍。4、4个抗菌肽基因的免疫功能研究检测象虫金小蜂寄生烟草甲高龄幼虫7天内4个抗菌肽基因的表达模式。与对照相比,LsAtt2持续高表达且在第1天表达量最高。LsDef1和LsDef2表达模式类似,均在前5天高表达,但LsDef1的表达量均高于LsDef2,表达第6天时LsDef2无显著变化。而LsCole在第2天和第3天时被显著抑制,其余时间无显著变化。通过RNAi技术对4个抗菌肽基因的表达进行有效抑制后,烟草甲4龄幼虫对E.coli和S.aureu的敏感性检测结果发现,LsAtt2和LsCole沉默后,E.coli和S.aureu胁迫处理下死亡率显著高于对照组,LsDef2和LsDef1处理组类似,仅有S.aureu处理组的死亡率显著提高。干扰后再寄生实验结果表明,LsAtt2、LsDef1和LsDef2表达抑制后,高龄幼虫死亡时间均有不同程度的提前,而LsCole基因与对照相差不大。