影响肿瘤发生、发展的机制尚不完全清楚。线粒体是细胞内重要的细胞器,线粒体功能不全是肿瘤细胞最重要的特征之一。研究表明,正常细胞与转化细胞之线粒体存在显著差异;将肿瘤细胞质与正常细胞融合形成的杂交细胞可能表现肿瘤源性特征,提示细胞质成分可能参与了肿瘤恶性表型的形成。线粒体是细胞质重要成分之一。线粒体DNA（mtDNA）缺失和突变广泛存在于多种肿瘤细胞,且可能与多种肿瘤的发生及肿瘤进展、转移等恶性表型有关。我们以肝癌细胞株SK-Hep1作为研究对象,经过溴化乙锭培养诱导20代后,成功的建立了mtDNA缺失的细胞株ρ⁰SK-Hep1,在对肿瘤细胞线粒体DNA缺失的细胞株生物学行为进行研究的基础上,进一步检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）和线粒体内Ca²⁺变化与肿瘤增殖的关系;构建含线粒体基因编码序列的靶向线粒体真核表达质粒,并以其转染mtDNA缺失的SK-Hep1细胞,检测线粒体基因表达状况,分析其与肿瘤表型变化的关系。初步探讨mtDNA损伤对肿瘤表型影响的机制。通过细胞脱核及胞质融合成功的构建了胞质体模型,为下一步研究细胞质成分对细胞生物学行为的影响提供了实验平台。目的1.线粒体DNA缺失的人肝癌细胞株ρ⁰SK-Hep1的建立及鉴定。2.观察线粒体DNA缺失的人肝癌细胞株ρ⁰SK-Hep1的生物学行为与亲本细胞的差别,检测ROS和线粒体内Ca²⁺变化与肿瘤细胞增殖的关系,探讨mtDNA损伤对肿瘤表型影响的机制。3.构建含线粒体编码的细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ基因并使其转染入ρ⁰SK-Hep1细胞,并对其构建的载体的生物学行为及表达进行观察及检测。4.通过细胞脱核及胞质融合构建胞质体模型,为下一步研究细胞质成分对细胞生物学行为的影响提供了实验平台。方法1.线粒体DNA缺失的人肝癌细胞株ρ⁰SK-Hep1的建立及鉴定采用溴化乙锭（EB）诱导,PCR、Southern杂交、Northern blotting、Western blotting及营养缺陷型方法进行鉴定。2.ρ⁰SK-Hep1与亲本细胞生物学行为差别的比较及其机制初步探讨以MTT法、Transwell细胞迁移实验观察ρ⁰SK-Hep1的的生长迁移;自发光荧光仪检测细胞内ATP浓度;荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察ρ⁰SK-Hep1内膜电位;流式细胞仪、荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察ρ⁰SK-Hep1内ROS对细胞增殖的影响;Fluo-4/ AM标记探针激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测静息状态下ρ⁰SK-Hep1细胞内Ca²⁺的浓度对肿瘤表型的影响。3.ρ⁰SK-Hep1细胞线粒体功能的部分恢复与检测应用真核表达载体Pmito-RFP质粒构建含线粒体编码的细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ,将表达载体PCOXⅠ-mito-RFP转染至ρ⁰SK-Hep1细胞内,MTT法检测生长状况、Western blotting检测细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ（Cytochrome oxidase subuni tⅠ,COXⅠ）蛋白的表达。4.胞质融合建立胞质体通过差速离心法制备无核的SK-Hep1胞质体细胞,应用聚乙二醇（PEG）将其与ρ⁰SK-Hep1细胞融合,建立胞质体。结果1.ρ⁰SK-Hep1细胞在含EB、无尿嘧啶和丙酮酸的选择培养基中从第1天始细胞逐渐悬浮、肿胀,培养第5天以后大量悬浮死亡,且贴壁疏松,10-12天细胞完全悬浮死亡。在含尿嘧啶和丙酮酸的选择性培养基中可以正常生长增殖成单层,有少量悬浮。同期非选择培养的SK-Hep1细胞生长正常。PCR结果显示,细胞色素氧化酶Ⅰ、Ⅱ（COXⅠ、COXⅡ）及内参G3PDH在SK-Hep1细胞中均可扩增出相应的条带,ρ⁰SK-Hep1细胞只见内参条带的形成。Southern、Northern杂交结果显示,ρ⁰SK-Hep1细胞未见COXⅠ、COXⅡ杂交条带形成,COXⅠ、COXⅡ蛋白在ρ⁰SK-Hep1细胞中无表达。2.ρ⁰SK-Hep1细胞内ATP浓度5.32nmol/mg,较亲本细胞Sk-Hep1ATP的量18.23nmol/mg明显下降（P<0.01）。线粒体膜电位检测:ρ⁰SK-Hep1肝癌细胞平均计数55.0,低于亲本细胞SK-Hep1肝癌细胞的平均计数65.9,相互间差异非常显著（p<0.01）;而FCM检测细胞内ROS荧光强度,ρ⁰SK-Hep1细胞显著高于SK-Hep1细胞（荧光平均计数35.5 vs 15.9,P<0.01）。细胞内钙离子浓度检测亦表明,ρ⁰SK-Hep1细胞荧光强度明显高于SK-Hep1细胞（488.94 vs 29.58, p<0.01）。3.成功构建了含线粒体编码的细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ的重组载体Pmito-RFP-COXⅠ,并以其转染ρ⁰SK-Hep1 , MTT法测定发现重组载体COXⅠρ⁰Sk-Hep1的生长速度快于其母本细胞株Sk-Hep1,低于线粒体DNA完全缺失的人肝癌细胞ρ⁰Sk-Hep1,Western blotting检测转染细胞可见COXⅠ蛋白的表达。4.差速离心法制备的无核的胞质体细胞经Giemsa染色后,倒置相差显微镜下可见大部分细胞质呈蓝色,未见明显的胞核紫红色。聚乙二醇（PEG）将其与ρ⁰SK-Hep1细胞细胞融合,培养5天后,可见一些小克隆出现,杂交细胞较大,呈园形,略透明。结论1.成功地构建了线粒体DNA缺失的人肝癌细胞株ρ⁰SK-Hep1,目前尚未见国内文献报道。除了从生长营养缺陷、PCR以及DNA水平上的Southern杂交等验证线粒体DNA是否完全缺失外,我们还从转录水平及蛋白水平上进行了检测,更进一步的证明了线粒体DNA完全缺失。2.线粒体DNA缺失的人肝癌细胞株在ATP的产量、膜电位水平显著低于其母本细胞株,而活性氧的产生高于其母本细胞,可能与低氧环境有关。3.ρ⁰SK-Hep1细胞内活性氧和钙离子浓度的增高可改变肿瘤细胞的表型,使得恶性程度更高,更易浸润转移。4.成功构建了线粒体编码的细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ的重组载体Pmito-RFP- COXⅠ,发现其生长速度快于其母本细胞株Sk-Hep1,低于线粒体DNA完全缺失的人肝癌细胞ρ⁰Sk-Hep1,部分恢复了线粒体的功能。5.采用胞质融合技术,成功的构建了胞质体模型,为下一步研究细胞质成分对细胞生物学行为的影响提供了实验平台。