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目的:探讨神经酰胺AD2646对人肺腺癌细胞A549体外生长的抑制作用和机理。方法:神经酰胺AD2646作用于人肺腺癌细胞A 549后,MTT法绘制细胞生长曲线,荧光分析检测Caspase-3活性,流式细胞术检测细胞周期,调亡细胞DNA电泳进行凋亡分析。薄层层析色谱分析(TLC)检测细胞葡糖苷鞘氨醇合成酶(GC)鞘磷脂合成酶(SM)水平,高效液相色谱分析(HPLC)检测细胞内神经酰胺水平。结果:本研究通过MTT法绘制神经酰胺AD2646作用于A549细胞后的生长曲线,发现神经酰胺AD2646处理组细胞的生长曲线较对照组出现了明显的下移;剂量越大,细胞的生长曲线下移更为明显;处理组细胞24h后即出现生长不良,72h后细胞稀疏,呈散在分布。荧光分析发现AD2646对A549细胞Caspase-3活性有明显影响。但Caspase-3活性增加主要表现在药物处理的早期,而且在观察时段内给药量与最终细胞生长抑制的强度及Caspase-3活性水平并不一致。FCM细胞凋亡分析及DNA电泳细胞调亡分析均表明,神经酰胺AD2646在体外抑制A549细胞生长过程中有凋亡现象发生,FCM分析还显示,在一定的时间与剂量范围内,AD2646诱导细胞凋亡,一定程度上还呈现剂量依从性。TLC法发现外源性神经酰胺AD2646在加量的早期即对A549细胞GC/SM活性有抑制作用,其中对GC的抑制作用比对SM的抑制作用更强,在加入神经酰胺AD2646作用后,20min即达到高峰,并在以后维持较高水平。高效液相色谱分析显示细胞内神经酰胺水平在加药早期即明显地迅速提高,30min~40min即达高峰,以后维持在一较高水平。结论:①神经酰胺作为脂质第二信使,参与调控细胞增殖、分化以及凋亡;其类似物AD2646可抑制肺腺癌细胞系A549的生长,抑制效应具有剂量与时间双重依从性;同时能诱导A549细胞凋亡,凋亡效应在一定程度上呈现剂量依从性。②Caspase-3虽参与了AD2646诱导的A549细胞凋亡,但可能还有其他效应路径参与了AD2646诱导的A549细胞凋亡。③外源性的神经酰胺AD2646在作用于A549细胞后,加量的早期对A549细胞GC/SM活性即有抑制作用,其中对GC的抑制作用比对SM的抑制作用更强。④细胞内神经酰胺水平在加药早期即显著地迅速提高,30min~ 40min即达高峰,以后维持较高水平而无明显进一步升高。⑤A549细胞的GC/SM活性受抑情况,胞内神经酰胺浓度的变化,与Caspase-3活性的早期检测结果并不平行,提示AD2646诱导A549细胞凋亡,除了Caspase蛋白酶家族,还应有其它的效应信号路径参与。第二部分神经酰胺AD2646对人肺腺癌细胞A549移植瘤生长的抑制作用观察目的:评价神经酰胺类似物AD2646对人肺腺癌A549裸鼠移植瘤生长的影响,为进一步应用于肺癌临床治疗提供实验依据。方法:建立裸鼠皮下移植瘤模型,将其随机分为三组,①神经酰胺AD2646治疗组:10mg/kg腹腔注射,接种后第一天开始,每间隔2天给药1次,共给药14次;②生理盐水对照组:注射NS,注射容积量及方法同第一组;③10%CE对照组:注射容积量及方法同第一组。观察移植瘤大小,末次给药24h后,脱颈椎处死裸鼠,解剖摘除皮下移植瘤,进行观察,并对裸鼠进一步行血液学、血清酶学、脏器病理学、肿瘤病理学观察;流式细胞仪术及TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡,RT-PCR及Western blot检测移植瘤细胞中Caspase-3 mRNA及蛋白表达。结果: 2周后,AD2646组与CE组及NS组移植瘤大小比较无明显差异;2周后~3周时,AD2646处理组瘤体显著小于NS组(P﹤0.01);但CE组也小于NS组(P﹤0.01)。AD2646组瘤体重量与CE组及NS组比较,P﹤0.01,有极显著统计学差异;CE组及NS组无并无统计学意义。肉眼及光镜下观察,各组裸鼠的心、肝、肺、肾等脏器均未见明显病理学改变。AD2646处理组WBC计数与NS组、CE组比较有明显差异(P﹤0.01),低于正常;而各组的红细胞、血小板计数均正常,各组间两两比较没有统计学差异。观察各组之间血清生化指标没有统计学差异。NS及CE组镜下主要表现为中分化腺癌的特点,瘤细胞呈浸润生长,坏死较少。AD2646处理组瘤组织中细胞数减少,较多的坏死灶,细胞核溶解,碎裂少。AD2646处理组G1期细胞较对照组为低,而G2+M期细胞比例则较高,两者均有统计学意义P﹤0.05。流式细胞术分析,AD2646处理组细胞凋亡率为9.61%,是对照组的3-4倍。TUNEL检测移植瘤细胞凋亡,计数5个高倍视野的阳性细胞,亦较对照组,明显较高;AD2646处理组Caspase-3 mRNA及蛋白表达也明显高于NS与CE组。结论:神经酰胺类似物AD2646可抑制人肺腺癌A549裸鼠移植瘤生长,诱导移植瘤细胞凋亡,增加移植瘤中Caspase-3 mRNA及蛋白表达,促进肿瘤细胞坏死,同时对裸鼠的主要脏器无明显毒副作用,虽可使白细胞减少,但对红细胞及血小板无不良影响,因此AD2646在肺腺癌化疗应用中具有巨大前景。