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研究背景:脓毒症是由细菌等病原微生物侵入机体,导致机体对感染的免疫应答反应失调,从而引起组织损伤和器官功能障碍。在脓毒症的发病过程中往往会发生严重的细胞因子风暴,加重宿主免疫应答反应异常,这是导致机体器官衰竭和死亡的主要原因之一。众所周知,细胞因子风暴是引起一些免疫炎症性疾病患者病情加重甚至死亡的主要原因之一,目前对其发生的机制不是十分清楚,尤其是不同免疫细胞在其发生过程中的作用有待进一步阐明。中性粒细胞作为一种重要的天然免疫细胞,在脓毒症发生发展过程中的作用是复杂的,一方面,它可以通过直接吞噬和杀伤微生物来发挥抗菌和免疫保护作用,也可以通过产生多种炎症因子间接来增强机体的免疫应答,另一方面,大量的中性粒细胞持续向感染部位迁移和大量炎症因子的释放,往往会导致机体免疫应答紊乱和组织损伤,进而无法控制和消除感染,这又促进了脓毒症发生发展。至今,中性粒细胞在脓毒症中的作用和靶向干预方案仍在研究和探索中。目前,临床上已经采用一些化学和生物类药物以及不同策略来治疗脓毒症,例如:广谱的免疫抑制剂、抗体类药物和血浆透析法等,其目的是通过降低机体细胞表达炎症因子和体液循环中的炎症因子（例如:肿瘤坏死因子等）,来减轻异常的免疫反应及其对组织器官的损伤。上述药物和疗法虽然在一些患者或脓毒症发病的早期取得了一定的疗效,但从患者总体分析和疾病的中后期疗效来看还存在着疗效不明显和预后较差的难题,有待深入研究和探索解决方案。芦可替尼是近年来临床上常规使用的一种靶向JAK家族的免疫抑制剂,最早用于治疗骨髓纤维化,目前已被用于一些细胞因子风暴相关的疾病的探索性研究。已有的一些研究结果表明该药物主要可以抑制多种免疫细胞的分化、迁移、增殖,进而抑制免疫细胞的活性及功能。至今,芦可替尼对T细胞、DC细胞、NK细胞等细胞的功能的影响已有一些文献报道,但其对机体中数量庞大的中性粒细胞的死亡和功能的影响尚不明确,尤其是在免疫性疾病状态下,芦可替尼对中性粒细胞的免疫反应的影响尚不清楚,亟需深入研究。研究目的:通过建立LPS诱导的小鼠脓毒症模型,观察小鼠体内中性粒细胞等免疫细胞及炎症指标,观察JAK抑制剂芦可替尼或/和TNF小分子抑制剂干预中性粒细胞和治疗脓毒症的效果。体外深入分析芦可替尼对中性粒细胞的功能以及存活的影响,揭示中性粒细胞在脓毒症中的免疫应答和作用,并为临床治疗脓毒症提供一种新的治疗策略。研究方法:LPS经腹腔注射诱导小鼠脓毒症模型,芦可替尼和C87均采用预给药方式;使用LEGENDplexTM因子试剂盒分析小鼠血清中炎症因子的表达水平;流式细胞术分析小鼠骨髓及外周血各系细胞比例。体外研究中设置芦可替尼溶剂对照组、0.1 μM芦可替尼处理组、1μM芦可替尼处理组和5 μM芦可替尼处理组。采用Percoll法分离小鼠骨髓中性粒细胞,经芦可替尼处理0h、24h、48h、72h后的中性粒细胞通过流式细胞术分析其纯度及早期凋亡、晚期凋亡情况,同时对中性粒细胞吞噬、趋化、杀伤功能进行检测;转录组测序分析基因表达差异;qPCR、Western Blot验证炎症相关基因表达及信号通路活化情况。研究结果:（1）构建LPS诱导的致死型脓毒症小鼠模型,72h后存活率为0,病理结果显示脓毒症小鼠肝、脾、肺中炎症细胞浸润增多,产生大量淤血,外周血中性粒细胞显著升高（P＜0.05）,小鼠血清中多种炎症因子如TNF-α、IL-1α、IL-6等显著升高（P＜0.05）;（2）通过芦可替尼预给药治疗LPS诱导的致死型脓毒症小鼠模型,存活率为50%（P＜0.05）,治疗后小鼠血清中部分炎症因子表达水平显著下降（P＜0.05）,如:IFN-γ、IL-1β;而仍有部分炎症因子表达水平显著升高（P＜0.05）,如:TNF-α、IL-1α。病理结果显示,脓毒症小鼠经芦可替尼治疗后肝、脾、肺淤血及炎症细胞浸润明显减少。经芦可替尼治疗后,流式结果显示脓毒症小鼠骨髓中性粒细胞比例显著下降,血常规结果显示外周血中性粒细胞比例显著升高（P＜0.05）。（3）构建Tnf-/-小鼠脓毒症模型或采用联合用药的方式（芦可替尼与TNF小分子抑制剂C87）治疗脓毒症小鼠（野生型）,结果表明,同时抑制JAK信号通路和Tnf的表达后,存活率均可达75%（P＜0.05）,治疗后小鼠血清中一些炎症因子表达水平显著下降（P＜0.05）,如:TNF-α、IL-1α、IFN-γ,病理结果显示,Tnf-/-小鼠经芦可替尼治疗后或联合采用TNF小分子抑制剂C87治疗的野生型小鼠肝、脾、肺淤血及炎症细胞浸润明显少于单独采用芦可替尼治疗后的野生型小鼠。（4）经0.1μM、1 μM、5 μM的芦可替尼处理后的中性粒细胞早期凋亡比例显著升高（P＜0.05）,吞噬酵母聚糖指数增强（P＜0.05）,趋化能力和杀伤大肠杆菌能力与芦可替尼溶剂对照组相比没有显著性差异。（5）RNA-seq结果表明芦可替尼处理后的中性粒细胞差异基因（Log2FC≥2）主要富集于炎症信号通路。经LPS刺激后,芦可替尼处理的中性粒细胞与对照组相比TNF-α、IL-6表达水平显著升高（P＜0.05）,LPS+Ruxo组的中性粒细胞中STAT3的磷酸化水平显著降低,活化的IκB-α蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。研究结论:芦可替尼对LPS诱导的脓毒症起治疗作用,而协同抑制TNF-α活性或敲除Tnf可明显提高芦可替尼对脓毒症的治疗效果。研究发现,芦可替尼可以加速中性粒细胞的早期凋亡,同时又促进中性粒细胞中TNF-α和IL-6等炎症因子的释放,影响了芦可替尼的疗效。本研究阐明了 JAK抑制剂芦可替尼在体外和小鼠体内对中性粒细胞的功能的影响,揭示了中性粒细胞来源的TNF-α与脓毒症的发生和发展具有密切联系,为今后临床治疗细胞因子风暴相关疾病的提供了一个治疗靶点和策略。