研究背景：肝衰竭是临床常见的严重肝病症候群,病死率高达60%以上,虽然肝移植是目前治疗肝衰竭的理想方法,但供体肝来源的严重缺乏和移植排斥等问题限制了其广泛开展临床应用。生物人工肝是目前肝衰竭患者最有希望获得较好疗效的体外治疗手段之一,它不仅为肝衰竭患者等待肝移植提供了过渡时间,并且还为可逆性肝衰竭患者恢复其肝功能,从而为避免肝移植提供了可能。目前生物人工肝研究的关键问题之一就是如何利用生物反应器在肝细胞体外培养中长时间维持肝细胞表型和分化功能。体外培养细胞功能改善的一个重要原则就是模拟体内细胞环境,由此,众多研究学者提出体外肝细胞三维培养是解决上述问题的有效途径。目前,国内外基于生物人工肝生物反应器肝细胞三维培养及其他能为之提供思路的体外肝细胞三维培养及肝组织构建的研究非常多,如中空纤维三维培养、微载体三维培养、球形聚集三维培养、Cell sheets三维培养、快速成型三维培养等,但相关研究存在共性缺陷：即都只是让肝细胞实现了在三维生长环境下生长培养,在肝细胞与非实质细胞共培养、肝细胞形成微结构的有序仿生排列、细胞与细胞、细胞与细胞基质间相互作用等肝细胞极性建立机制上都都存在诸多问题没有解决,而且肝细胞功能活力也无法与肝细胞在体相比较。由于肝脏本身就是一个极佳的肝细胞培养反应器,生长于肝脏中的肝细胞不仅达到了数量和密度上的要求,而且呈有序极性肝板排列。研究表明,肝细胞极性是肝脏独特生理功能的基础。鉴于上述肝细胞极性与功能的密切关系,仿生肝脏结构的三维培养模式有望成为解决上述问题的有效途径。而且体外肝细胞三维培养设计只有最大程度地接近正常肝脏内肝细胞微环境及结构,能够仿生“肝小叶”、“肝板”,同时,将这一理念与生物人工肝生物反应器结合,实现生物反应器的仿生组织工程化设计,才能最大程度维持肝细胞活力功能、分化表型。研究目的：本实验研究正是基于微流控芯片三维培养技术,通过借鉴肝细胞在肝脏的极性肝板排列,以及其与非实质细胞、细胞外基质相互作用的仿生学原理,提出仿肝板结构肝组织三维培养技术研究课题,认为仿肝板结构三维培养有助于重建和维持肝细胞极性从而使肝细胞在体外培养中具备更接近于体内细胞的表型和分化功能。本项目拟利用微流控芯片技术在体外构建仿肝板结构肝组织,通过对这种培养模式下肝细胞功能进行测定并与其他体外培养模式相比较,以期得到新的适于生物人工肝应用的体外肝细胞培养模式以及新型生物反应器,为生物人工肝、肝组织工程、细胞移植治疗、肝脏病理生理等进一步研究奠定基础。实验方法：1、设计、制作微流控芯片：经过前期大量文献调研、反复设计、验证,确定芯片的制作工艺为传统软光刻和再铸模技术,制作材料为聚二甲硅氧烷(PDMS),以及芯片设计数据,后期通过我们的合作方(中国科学院上海微系统与信息技术研究所)对芯片进行加工制作,最终完成芯片的制作。2、实验用细胞、藻酸盐水凝胶及胶原制备所需溶液准备、实验组及对照组设计：①实验用细胞准备：a.人肝细胞系：(1)C3A (2)HepGL (3)CL-1(LO2)b.人内皮细胞系：EA.hy926c.细胞培养基：DMEM+10%FBS+1%双抗②藻酸盐水凝胶制备所需溶液准备(详见正文部分)：③实验组及对照组设计：实验组：仿肝板结构有序三维共培养(其中C3A:EA.hy926=3:1)对照组1：混合式三维共培养(其中C3A:EA.hy926=3:1)对照组2：混合式二维共培养(其中C3A:EA. hy926=3:1)每组设立4个复孔。3、仿肝板结构有序三维共培养、混合式三维共培养、混合式二维共培养实验具体操作(以C3A为例)：①实验组(仿肝板结构有序三维共培养)操作：将海藻酸钠C3A及EA. hy926细胞溶液、缓冲液及胶凝液在微量注射泵的作用下持续通入微流控芯片内。海藻酸钠C3A细胞悬液、海藻酸钠EA. hy926细胞悬液、缓冲液、胶凝液流速为20ul/min、 10ul/min、15ul/min、4ml/h(约66.7ul/min)。由于这四种液体流达到层流条件,当这几种液体在主反应通道交汇后,便开始形成包裹肝板结构的水凝胶。形成水凝胶后,将其导入装有培养基的TissueFlex(?) Microbioreactors内进行三维动态灌注培养。其中,为摸索最佳流速条件,细胞是否形成肝板样排列,我们采用不同颜色染料进行实验分析,找出四种溶液通入微流控芯片的最佳方案及流速,然后再进行具体实验验证,采取活细胞双荧光标记,激光共聚焦显微镜下即时观察C3A和EA. hy926的肝板样位置排布；②对照组1(混合式三维共培养)操作：将C3A和EA. hy926混合后通入芯片,其余步骤同实验组(仿肝板有序三维共培养)；③对照组2(混合式二维共培养)操作：只需将两种细胞混合后接种到TissueFlex(?) Microbioreactors中培养即可；待水凝胶内形成稳定的肝板结构时,将水凝胶浸泡在藻酸盐裂解酶液中,即可获取仿肝板肝组织。4、对以上实验组和对照组进行肝细胞活力、形态组织学、功能、基因表达水平等进行动态检测：①形态结构动态观察：倒置显微镜下动态观察；观察时间分别为第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13天。②组织学形态观察：双免疫荧光；分别选取第5、7、10、13天来对仿肝板结构肝组织以及混合式三维培养下形成的肝组织形态进行观察与鉴定。③活力动态检测：CCK-8；检测时间分别为第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13天。④功能动态检测(蛋白质检测)：胆红素、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、白蛋白、转铁蛋白、α1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A1、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、氨甲酰磷酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、尿素、氨、CYP3A4、 CYP1A2、CYP2D6、安定、谷胱甘肽-S-转移酶、凝血因子Ⅱ、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、孕激素X受体、睾酮；检测时间分别为第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13天。⑤基因表达水平动态检测(RT-PCR):葡糖醛酸基转移酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、白蛋白、转铁蛋白、α1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A1、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、氨甲酰磷酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、CYP3A4、CYP1A2、CYP2D6、谷胱甘肽-S-转移酶、凝血因子Ⅱ、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、孕激素X受体、肌动蛋白β(内参)；检测时间分别为第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13天。5、收集数据、统计分析、得出结论：所有数据的统计学处理以均数±标准差表示,每组至少重复三次。组间差异通过one-way ANOVA检验,然后再做Turkey或Games-Howell post-hoc检验,所有统计分析均采用SPSS 13.0软件进行。当P值<0.05时,数据分析才有显著性差异,即具有统计学意义。实验结果：1、设计、制作微流控芯片：经过大量文献调研、反复设计、实验验证,我们所设计的微流控芯片可用于仿肝板结构肝组织三维构建,芯片设计合理可行。2、仿肝板结构肝组织三维培养方法步骤：将培养好的3瓶182cm2培养瓶C3A细胞和2瓶182cm2及2瓶75cm2培养瓶EA. hy926细胞消化处理,分别可获取6×107和4× 107细胞,然后将细胞混悬于海藻酸钠溶液中,制备单细胞悬液。将海藻酸钠C3A及EA.hy926细胞溶液、缓冲液及胶凝液通入微流控芯片内。其中,先通入缓冲液,再通入海藻酸钠C3A细胞溶液、海藻酸钠EA.hy926细胞溶液,最后通入胶凝液。这四中液体通入芯片内的速度分别为：海藻酸钠C3A细胞溶液为20ul/min,海藻酸钠EA. hy926细胞溶液为10 ul/min,缓冲液为15 ul/min,胶凝液为4ml/h(约66.7ul/min)。由于通入芯片内的液体流可达到层流状态,即肝细胞溶液在芯片主反应通道(成胶区)的中间流动,内皮细胞溶液在肝细胞溶液两边分布,然后内皮细胞溶液外围是缓冲液,最外边的液体为胶凝液,肝细胞与内皮细胞呈现肝板结构样排布,所以最终形成了包裹肝板结构的水凝胶,水凝胶束平均直径约为100um左右。3、不同颜色染料流体分析、及活细胞双荧光标记验证形成肝板样结构的细胞排布：通过应用不同颜色染料进行流体分析,得出上述四种液体的流速条件满足层流条件；进一步活细胞双荧光标记结果显示,我们制备出了包裹肝板结构的水凝胶束,水凝胶束内包裹着C3A细胞和EA. hy926细胞,其中C3A细胞在中间,约有2到3排,EA. hy926细胞位于C3A细胞两侧,呈现肝板结构排布。4、对以上实验组和对照组进行肝细胞形态结构的动态观察：仿肝板结构三维共培养组中,肝细胞与内皮细胞共培养,并呈有序肝板结构排列生长,培养初期,肝细胞与内皮细胞会呈现出增值的趋势,随着细胞增值到一定数量,由于水凝胶的外包被束缚,肝细胞会逐渐与内皮细胞融合成一体,形成一个微型肝组织条索,细胞增殖几乎停滞,处于维持阶段,细胞存活良好。混合式三维共培养组中,肝细胞与内皮细胞共培养,但呈无序混合排列生长,培养初期,肝细胞与内皮细胞会呈现出增值的趋势,随着细胞增值到一定数量,由于水凝胶的外包被束缚,肝细胞会逐渐与内皮细胞融合成一体,形成一个微型肝组织条索,细胞增殖几乎停滞,处于维持阶段,细胞存活良好,但细胞形态较仿肝板结构三维共培养组略差。混合式二维共培养组中,肝细胞与内皮细胞共培养,但呈无序混合排列生长,培养初期,肝细胞与内皮细胞会呈现出增值的趋势,随着细胞增值到一定数量,细胞长满,生长空间受限,细胞接触抑制,随着培养时间延长,细胞形态变差,趋向凋亡。实验结论：运用我们所设计制作的微流控芯片、在反复摸索微流控条件及实验验证下,成功构建了仿肝板结构肝组织,并建立了相关技术体系,为体外肝细胞三维培养提供了一种新的培养模式,有望使肝细胞在体外培养中具备更接近于体内细胞的表型和分化功能,同时也为后续实验奠定了基础。而且该研究采用的均为人源性细胞,所形成的研究成果将能更好地应用于生物人工肝、细胞移植治疗、药物检测与评价等临床应用研究之中。