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目的:心肌梗死、慢性心血管疾病等造成的心肌损伤会导致纤维性瘢痕组织形成,影响心脏的搏动及泵血功能。构建以种子细胞和生物材料为基础的工程化心肌组织有望为受损心肌的修复提供重要的候选方法;此外,工程化心肌组织也可为药物心脏毒性的评价提供体外快速筛选途径。支架材料能为细胞提供合适的人造细胞外基质、力学以及电学微环境,促进心肌细胞分化和成熟,在工程化心肌组织构建中具有关键作用。天然心肌是电活性组织,其中分布着具有电传导功能的浦肯野纤维。源自窦房结的电信号通过心肌时,通过“兴奋-收缩”耦联作用诱发心肌细胞同步收缩。与此同时,心肌组织还具有优良的力学强度,能够支持心脏搏动时持续的收缩和舒张。因此,用于工程化心肌组织构建的支架材料应同时具有优良的导电性和弹性模量。水凝胶材料能吸收并保持大量水分,利于细胞营养物质及代谢产物的运输,理化性质可调控,在心肌组织工程中得到大量的研究。但单一成分的水凝胶通常为电绝缘材料,不利于细胞间电信号的传递;此外,水凝胶的模量通常比较低,在支持心肌细胞收缩方面尚不理想。本课题模拟天然心肌组织中浦肯野纤维的分布和电传导功能,以高电导率和高模量的碳纤维(CF)与生物相容性良好的聚乙烯醇(PVA)复合,利用CF的特性提高PVA水凝胶的导电性和力学性能,构建碳纤维增强聚乙烯醇导电水凝胶(PVA/CFs),系统研究PVA/CFs对心肌细胞增殖、成熟及电生理功能的作用,以及心肌细胞-水凝胶复合体(NRCM@PVA/CFs)对药物的响应,研究PVA/CFs对血管内皮细胞粘附连接和巨噬细胞炎性反应的作用,为心肌缺损修复及心血管系统药物的体外筛选提供新材料和新方法。方法:应用反复冷冻-融化方法制备碳纤维含量不同的碳纤维增强聚乙烯醇导电水凝胶(PVA/CFs);通过扫描电子显微镜观察微观结构,用四探针测试法测定直流电导率,用电子万能试验机检测材料弹性模量,采用重量法测定平衡溶胀比及降解行为。通过CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8)检测大鼠原代心肌细胞(Neonatal Rat Cardiomyocytes,NRCMs)、大鼠心肌细胞系(H9c2)、人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)、小鼠巨噬细胞(RAW264.7)在 PVA/CFs上的生长、增殖规律,使用LIVE/DEAD试剂检测NRCMs的细胞活率。通过免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜(Laser scanning Confocal Microscopy)观察NRCMs、H9c2和HUVEC的生长形态、心肌成熟相关蛋白α-actinin、cTnT、Cx43的表达,以及HUVEC细胞钙黏蛋白VE-Cadherin的表达。通过Western Blot进一步半定量分析与细胞功能相关蛋白α-actinin、cTnT、Cx43、VE-Cadherin的表达,并研究了碳纤维对NRCMs细胞α5β1-integrin/ILK/p-AKT力学信号转导通路的作用。使用钙离子荧光探针Fluo 4-AM及活细胞高速激光共聚焦实时成像分析系统检测NRCMs细胞在自发搏动过程中及化疗药物阿霉素和心率调节药物异丙肾上腺素处理前后钙离子浓度的动态变化。应用Real Time PCR方法检测RAW264.7炎性反应相关基因TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的表达,通过 ELISA 试剂盒检测 RAW264.7 分泌 TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子的水平。结果:(1)通过反复冷冻-融化方法制备了碳纤维增强聚乙烯醇导电水凝胶(PVA/CFs),碳纤维均匀分布在聚乙烯醇水凝胶内,凝胶表面形成近似天然细胞外基质微观结构的均匀贯通微孔结构,PVA/CFs具有利于心肌细胞营养物质和氧的扩散的高溶胀比;其电导率在0.1-0.4S/m之间,显著高于PVA,并与心肌组织的电导率(0.03-0.6 S/m)接近;其弹性模量与天然心脏收缩时相近。(2)PVA/CFs支持大鼠原代心肌细胞NRCMs、大鼠心肌细胞系H9c2、人脐静脉内皮细胞HUVEC、小鼠巨噬细胞RAW264.7的正常生长和增殖;可诱导心肌细胞骨架蛋白的组装和取向分布,促进心肌细胞向成熟表型分化;有利于HUVEC形成典型的“鹅卵石样”内皮细胞形态和表达细胞间粘附蛋白VE-Cadherin;不改变RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表达水平及相应蛋白的分泌水平。(3)PVA/CFs能够显著上调三种与心肌细胞成熟相关蛋白Cx43、α-actinin和cTnT的表达,有利于增强原代心肌细胞NRCMs的自发搏动能力;在PVA/CFs水凝胶上生长的NRCMs表现出更为规律、同步、增强的搏动行为。所构建的细胞-水凝胶复合体(NRCM@PVA/CFs)暴露于心脏毒性药物阿霉素时,与NRCM@PVA相比,可以在更长的时间内保持有效的搏动;当暴露于加快心率药物异丙肾上腺素时,可快速响应药物的作用而改变搏动速率。(4)机理研究结果表明,CFs激活了 α5β1整合素介导的α5β1-integrin/ILK/P-AKT力学信号转导通路,并上调了 Rho家族小GTP酶RhoA、缺氧诱导因子HIF-1α的表达。结论:碳纤维增强聚乙烯醇导电水凝胶PVA/CFs通过激活α5β1整合素介导的力学信号转导通路和上调RhoA、HIF-1α,显著增强原代大鼠心肌细胞的体外成熟及电生理功能;与传统培养的细胞相比,所构建的原代心肌细胞-导电水凝胶复合体(NRCM@PVA/CFs)对心脏毒性药物和加快心率药物具有更为优异的响应功能。此外,PVA/CFs支持原代人脐静脉内皮细胞和小鼠巨噬细胞的生长,利于细胞间形成完整的内皮连接,同时不会引起巨噬细胞明显的炎性反应。