论文部分内容阅读
苎麻[Boehmeria nivea(Linn.)Gaud.]是我国重要的可再生纺织原料作物，具有较大经济利用价值。苎麻经长期的异花授粉导致遗传背景非常复杂，自然和人工选择导致部分性状(基因)的丢失，遗传学与分子生物学研究基础十分薄弱。利用传统育种的方法改良纤维品质虽已取得较大成功，但仍有一些无法解决的问题，例如降低木质素含量便难以通过常规育种来实现。通过栽培或生产措施来控制木质素含量可操作性不强。通过基因工程技术改良苎麻品质进行低木质素育种，降低木质素的含量或改变其组分，将是苎麻遗传改良非常有前景的领域。本研究采用RT-PCR的方法，首次克隆了苎麻内源的CCoAOMT新基因，分析苎麻CCoAOMT基因序列，分别构建了苎麻和烟草的反义CCoAOMT基因表达载体，并通过农杆菌介导进行遗传转化的探索。本文的主要研究结果如下：(1)改良并建立了采用TRIZOL试剂提取高质量总RNA的方法，优化RT-PCR扩增反应条件和RACE反应技术路线，为从富含多酚和多糖等多种次生代谢物质的植物中分离高质量总RNA，通过逆转录技术克隆目的基因提供了科学、简便、实用的方法。(2)首次克隆了苎麻植物中的咖啡酰CoA甲基转移酶新基因全长cDNA序列，并登录GenBank，获得登录号为AY651026。在线进行保守区域分析，结果表明苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶是氧甲基转移酶类。在3种水平即基因包括3’UTR、5’UTR和编码区序列的mRNA序列、mRNA编码区序列以及氨基酸序列进行比对，并构建系统发生树。分析结果显示，苎麻(Boehmeria nivea)的CCoAOMT基因包括3’UTR、5’UTR和编码区序列的mRNA序列与已报道的其他植物的相应序列不能聚为一类，其差异明显大于其他植物间的差异。苎麻(Boehmeria nivea)的CCoAOMT基因mRNA编码区序列(AY651026)与玉米(Zea mays：ZMA242980、ZMA242981)的同源性高于其他植物。苎麻(Boehmeria nivea)CCoAOMT酶蛋白氨基酸序列(AY651026)与杨树(Populus balsamifera：AJ224894、AJ224896)、美洲山杨(Populus tremuloides：PTU27116)的同源性高于其他植物。(3)采用蛋白质表达系统构建了苎麻CCoAOMT cDNA编码区的高效表达载体pQE-30-BNCCOAOMT，在大肠杆菌中高效表达了苎麻咖啡酰CoA甲基转移酶蛋白，得到目的蛋白质分子量为29.4 kD。(4)首次克隆了苎麻四个栽培品种CCoAOMT基因基因组序列，分别登录GenBank，并获得登录号为：AY818191(湘苎3号)、AY822619(圆麻)、AY822620(芦竹青)和AY822622(青麻)。序列分析结果表明，在苎麻4个栽培品种的CCoAOMT基因的基因组DNA片段序列，序列长度不同，各含有3个内含子，内含子序列有差异。在DNA的编码区，仅有5个碱基位点具有多态性。对苎麻4个栽培品种进行DNA序列同源性和进化树分析，序列间比对分值表明4个栽培品种之间同源性在96％以上。(5)克隆的烟草CCoAOMT基因包含了整个读码框序列的长度为862bp的全长cDNA序列，与烟草CCoAOMT-2基因mRNA全长CDS(GenBank登录号U62734)同源性为98％。(6)构建了烟草CCoAOMT基因反义表达载体pBI121-antiNTCCoAOMT，获得工程农杆菌LBA4404(pBI121-anti NTCCoAOMT)。构建了苎麻CCoAOMT基因反义表达载体pBI121-antiBNCCoAOMT，获得工程农杆菌LBA4404(pBI121-antiNTCCoAOMT)，用于对植物的遗传转化。(7)建立了一套苎麻叶片外植体再生体系。确定了对苎麻转化体和非转化体进行筛选的Kan浓度为25 mg／L。建立了程序化的农杆菌介导苎麻叶片遗传转化的体系。(8)通过工程农杆菌介导烟草反义CCoAOMT基因表达载体(pBI121-anti NTCCoAOMT)转化苎麻，PCR检测结果初步证明苎麻转基因小植株已经获得外源基因。通过工程农杆菌介导苎麻反义CCoAOMT基因表达载体(pBI121-anti BNCCoAOMT)转化苎麻叶片，获得抗性愈伤组织。通过工程农杆菌介导苎麻反义CCoAOMT基因表达载体(pBI121-antiBNCCoAOMT)转化模式植物烟草W38，获得了抗性植株。上述研究结果为深入研究苎麻内源的CCoAOMT基因及其编码蛋白在苎麻木质素代谢中的功能提供了理论与实验依据。为最终获得木质素含量下降或组分改良的转基因苎麻，创造适合我国国情环保型低木质素苎麻转基因新品种奠定了基础。