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在前期课题组以糖皮质激素诱导建立斑马鱼骨质疏松模型基础上，本论文进一步建立骨代谢标志酶（碱性磷酸酶）的检测并探讨了维甲酸诱导斑马鱼骨质疏松的合理性，以完善斑马鱼骨质疏松模型;用斑马鱼骨质疏松模型评价筛选了朝鲜淫羊藿抗骨质疏松活性成分（组分）;面向体内、外成分抗骨质疏松评价，提出斑马鱼骨质疏松模型与斑马鱼代谢模型联合的二维斑马鱼模型构想，并成功评价了淫羊藿中代表黄酮及其代谢产物的抗骨质疏松活性。 1.斑马鱼骨质疏松模型的完善 (1)斑马鱼骨代谢标志物碱性磷酸酶的检测 首次采用斑马鱼碱性磷酸酶为检测指标，以糖皮质激素泼尼松龙为模型药，以期完善前期建立的斑马鱼骨质疏松模型。采用碱性磷酸酶试剂盒法对培养至9dpf的斑马鱼幼鱼组织匀浆液进行碱性磷酸酶活性的检测，比较各组碱性磷酸酶的活性差异。结果与溶媒阴性对照组相比，25μmol· L-1和100μmol·L-1浓度泼尼松龙组的斑马鱼碱性磷酸酶活性显著降低，提示泼尼松龙使斑马鱼碱性磷酸酶活性显著降低。并用该模型指标成功考察了仙灵骨葆片(2.5μg·mL-1、15μg·mL-1、30μg·mL-1和100μg·mL-1)不同浓度防治骨质疏松的作用。 (2)维甲酸诱导斑马鱼骨质疏松模型的合理性研究 不同浓度的维甲酸均使斑马鱼骨骼产生致畸作用，随浓度增大致畸作用增强，严重可致幼鱼死亡;与对照组0.4％ DMSO相比，低浓度0.1μmol·L-1和1μmol·L-1的维甲酸使斑马鱼幼鱼致畸较轻微;但是高浓度10μmol·L-1、25μmol· L-1、50μmol·L-1的维甲酸使斑马鱼致畸严重，从茜素红染色区域可以看出，维甲酸作用过后的斑马鱼幼鱼脊柱提前骨化。 通过维甲酸对斑马鱼胚胎的毒性暴露实验，研究了维甲酸对斑马鱼早期发育的骨骼致畸毒性，心脏毒性及致死和亚致死毒性效应。维甲酸对斑马鱼胚胎的自主运动、心跳和孵化能力均造成了明显不利影响，并且胚胎在毒性暴露过程中均产生了明显的畸形特征。1、10、25、100μmol·L-1的维甲酸对胚胎和幼鱼产生致畸效应，胚胎和幼鱼表现出的主要畸形特征有心包水肿、心脏形态线性化、卵黄囊肿胀、血细胞在心区堆积、而且心率也随着浓度的升高和作用时间的延长而明显下降。100μmol· L-1的维甲酸抑制胚胎和仔鱼的心跳及孵化能力，且对胚胎和仔鱼造成致死效应。 2.应用斑马鱼骨质疏松模型评价朝鲜淫羊藿的抗骨质疏松活性 应用斑马鱼骨质疏松模型评价淫羊藿总提物、部位、总黄酮及单体成分（朝藿定B、箭藿苷B、淫羊藿素）的抗骨质疏松活性。 淫羊藿经大孔树脂分离所得的各部位中，除水部位组外，30％乙醇部位1μg/mL组的IOD值、50％乙醇部位1μg/mL、100μg/mL和1000μg/mL组、70％乙醇部位10μg/mL和100μg/mL组、90％乙醇部位100μg/mL和1000μg/mL组的矿化面积之和及IOD值与模型组相比具有显著性或极显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。结果提示除了水洗部位外，淫羊藿总提物及淫羊藿D101树脂30％、50％、70％和90％乙醇洗脱部位均可阻止泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松。色谱分析表明30％，50％，70％和90％乙醇洗脱部位主含黄酮类成分和少量非黄酮类化合物。 与模型组比较，当淫羊藿总黄酮浓度为6μg·mL-1时，斑马鱼头骨染色面积和IOD与模型组比有极显著性差异(P＜0.01)。 与模型组比较，朝藿定B浓度为0.2μmol·L-1及1μmol· L-1时，斑马鱼头骨染色面积之和与IOD和模型组比有极显著性差异(P＜0.01)，当朝藿定B浓度为5μmol· L-1和10μmol· L-1时，却无显著性差异。箭藿苷B浓度为1μmol·L-1时，斑马鱼头骨染色面积之和与IOD和模型组比分别有显著性差异(P＜0.05)和极显著性差异(P＜0.001)，当箭藿苷B浓度为5μmol· L-1时，则分别有极显著性差异(P＜0.01)和显著性差异(P＜0.05)。淫羊藿素浓度为0.2μmol·L-1时无显著性差异，当浓度增加至1μmol·L-1时，斑马鱼头骨染色面积和IOD与模型组比有极显著性差异(P＜0.01)。结果提示0.2μmol· L-1及1μmol·L-1朝藿定B和1μmol· L-1及5μmol·L-1箭藿苷B和1μmol·L-1淫羊藿素可对抗泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松。 斑马鱼骨质疏松模型具简单、高效、化合物用量少及可操作性强的优势，其评价中药成分特别是量微成分及其复杂体系活性具科学性与合理性。 3.二维斑马鱼模型的建立及淫羊藿中代表黄酮的抗骨质疏松活性评价 斑马鱼代谢模型和骨质疏松模型联合色谱技术评价淫羊藿中代表成分淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定C及其代谢成分的抗骨质疏松活性。斑马鱼成鱼代谢模型对量微原型成分进行在体代谢;现代色谱及其联用技术为中药复杂体系及代谢成分的分离、分析提供有力保障;斑马鱼幼鱼骨质疏松模型用于原型成分及代谢产物的抗骨质疏松活性的在体高效评价。三者优势有机、巧妙的整合与发挥，突破评价模型和化合物数量的瓶颈，使淫羊藿中量微成分及其代谢产物的富集、分离分析、在体抗骨质疏松活性评价一体化，简单、高效。