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体外培养的人牙髓细胞(human dental pulp cells，HDPCs)是一种多潜能的异质性细胞群体，其中包含具有增殖和分化能力的前体细胞／干细胞。牙髓细胞的增殖、迁移和向成牙本质样细胞的分化等参与了牙髓损伤的再生修复过程。基质细胞衍生因子-1(stromal cell—derived factor-1，SDF-1)是趋化因子(chemokine)CXC亚家族成员之一，CXCR4为其特异性受体。SDF—1与CXCR4结合构成的SDF-1-CXCR4轴具有广泛的生物学作用，可参与调节多种生理病理过程。近年研究发现多种组织或器官中的组织定向干细胞(tissue-committed stem／progenitor cells，TCSC)表达CXCR4，并能沿SDF-1的浓度梯度进行迁移，从而在组织损伤后的再生修复中发挥重要作用。我们推测牙髓损伤时引起SDF-1等趋化因子的释放，HDPCs可表达CXCR4，使得HDPCs按趋化因子指引的方向向牙髓受损处迁移从而修复损伤组织。本课题组前期研究发现：炎症牙髓组织中SDF-1和CXCR4强阳性表达，正常牙髓中基本少见或未见表达。因此，本实验拟研究SDF-1-CXCR4轴对HDPCs增殖、凋亡、迁移和碱性磷酸酶活性的影响，为深入了解SDF—1—CXCR4轴在牙髓损伤再生修复中的作用机制提供新思路。
目的：研究体外培养人牙髓细胞CXCR4的表达情况，检测脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激后HDPCs培养上清液中SDF-1的表达水平，探讨外源性人工重组SDF—1(recombinant human SDF—1，rhSDF-1)对HDPCs增殖、凋亡、迁移和碱性磷酸酶活性的影响。
方法：①采用酶消化组织块法进行HDPCs的原代培养：免疫细胞化学进行细胞来源鉴定；取第3～5代HDPCs，MTT法测定细胞生长曲线；间接免疫荧光技术检测HDPCs上CXCR4的表达情况。②用不同浓度LPS(0.1、1、10、100μg／ml)和TNF-α(1、10、100ng／ml)刺激HDPCs 48h后，ELISA法检测细胞培养上清液中SDF—1含量的变化。③用含有不同浓度rhSDF-1(5、50、100、200ng／ml)的培养基分别培养HDPCs 48h和72h后，MTT法观察细胞增殖的情况；同时，AnnexinV／PI法观察100ng／ml rhSDF-1作用HDPCs 48h时对细胞凋亡的影响。④体外趋化实验观察不同浓度rhSDF-1(10、30、50、100ng／ml)对HDPCs迁移的影响。⑤用不同浓度rhSDF-1(1、10、30、50、100ng／ml)的培养基连续培养HDPCs 15d后，检测细胞内ALP活性的变化。
结果：①酶消化组织块法可有效进行HDPCs的原代培养。免疫细胞化学显示所获得的细胞均为抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性。MTT结果显示细胞具有较强的增殖活性。免疫荧光显示HDPCs胞膜表达CXCR4。②ELISA结果显示未受刺激的对照组HDPCs分泌SDF-1，浓度约为(4513.551±962.918)pg／ml。不同浓度LPS和TNF-α刺激HDPCs 48h后，除100ng／ml TNF-α组外(P>0.05)，其余各实验组的SDF-1表达量均较对照组显著降低(P<0.05)。③MTT结果显示：48h时各实验组的OD值均高于对照组，除5ng/ml外，其余各实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；但72h时各实验组与对照组间均无统计学差异(P>0.05)。Annexin V／PI结果提示100ng／ml rhSDF-1对HDPCs的凋亡无明显影响(x2=0.272，P=0.602)。④体外趋化实验结果显示，除30ng／mlrhSDF-1组外(P>0.05)，50ng／ml和100ng／ml两浓度组与对照组问均有显著差异(P<0.01)，且随着rhSDF—1浓度的升高其趋化作用逐渐增强。相关分析表明，rhSDF-1浓度与其趋化的细胞数呈正相关(rs=0.634，P<0.01)。⑤不同浓度rhsDF-1作用于HDPCs 15d后，除1ng／ml和10ng／ml两浓度组外，其余各实验组ALP活性均明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。ALP活性在50ng／ml时达到最大值，超过此浓度时，其刺激作用不再随浓度的升高而增强。
结论：HDPCs表达CXCR4并分泌SDF-1，LPS和TNF-α可抑制HDPCs分泌SDF-1。
同时，外源性rhSDF-1能促进HDPCs的增殖、迁移和ALP活性，但对细胞的凋亡无明显影响。提示SDF-1-CXCR4轴可能在牙髓组织损伤修复中发挥重要作用。