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磷脂酶A1是生物体内参与众多生理功能的重要酶类,作为诸多病原微生物的毒力因子与致病性直接相关。由于磷脂酶A1催化磷脂产生溶血磷脂的特性,广泛应用于食品、制药等工业,尤其由于用于植物油脱胶时具有高效率、低能耗、低污染的优势而受到广泛的关注和应用。沙雷氏菌磷脂酶A1下游的辅助蛋白基因可以促进其在大肠杆菌中的高效表达,研究辅助蛋白与磷脂酶A1活性间的关系无论是对于细菌磷脂酶A1的工业应用还是阐明细菌致病性机制都具有重要意义,本文主要进行了以下几个方面的研究：(1)以实验室筛选的粘质沙雷氏菌PL-06基因组为模板扩增得到磷脂酶A1基因(plaA),磷脂酶A1辅助蛋白基因(plaS)及磷脂酶A1+辅助蛋白基因(plaB),测序与NCBI登录基因相似度高于95%,plaB由plaA和plaS两个基因重叠构成是典型的重叠基因。经生物信息学软件预测得到磷脂酶A1(PlaA)和辅助蛋白(PlaS)相关结构信息,序列保守性较高,经预测PlaA蛋白是典型的α/β水解酶类,PlaS则属于广泛参与蛋白之间作用的锚蛋白(ANK)家族,该结构可能与其对磷脂酶A1活性表达促进作用有关。(2)将plaA,plaS和plaB基因分别与pET-28a(+)连接转化BL21,构建大肠杆菌表达菌株AP28,SP28和BP28。综合三个基因大肠杆菌表达结果如下：AP28菌株磷脂酶A1蛋白表达量远高于BP28菌株,但是AP28发酵上清酶活为1.2U/mL比酶活为78.94U/mg, BP28上清酶活为16U/mL比酶活达到311.65U/mg,因此确认辅助蛋白对磷脂酶A1在大肠杆菌中的高活性表达是必要的；单独表达辅助蛋白基因对宿主大肠杆菌的生长具有抑制作用；在BP28菌株中辅助蛋白与磷脂酶A1共表达时,由于有活性的磷脂酶A1的作用对宿主的抑制作用更加明显且发酵上清中含有大量菌体蛋白。(3)AP28菌株磷脂酶A1蛋白表达量较高,但是大多为无活性的包涵体,包涵体变复性条件经优化后蛋白回收率可达188.75μg/mL,酶活为12U/mL,但是比酶活仅为63.58U/mg。(4)分别构建plaA(?)plaB基因的枯草芽孢杆菌WB600表达菌株AW和BW。与大肠杆菌表达结果相似,BW菌株的磷脂酶A1酶活远高于AW, AW和BW的最高酶活分别为1.2U/mL和7.2U/mL,说明辅助蛋白同样促进磷脂酶A1在枯草芽孢杆菌中的高活性表达；而且在BW中磷脂酶A1与辅助蛋白共表达时菌体生长明显受到抑制。总之,粘质沙雷氏菌来源的磷脂酶A1基因下游的辅助蛋白基因对磷脂酶A1原核高活性表达是必须的,同时也发现辅助蛋白会抑制宿主菌的生长。这一结果为细菌磷脂酶A1高活性异源表达以及以磷脂酶A1为毒力因子的细菌毒性表达机制研究提供依据。