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天冬氨酸族氨基酸（赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸）是动物和人体所必需氨基酸，但是人体自身不能合成，微生物可利用前体物质—天冬氨酸，经一系列代谢途径合成。高丝氨酸脱氢酶（homoserine dehydrogenase，HSD）是天冬氨酸族氨基酸生物合成途径中的一个关键酶，对蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸的合成起重要作用。微生物中的天冬氨酸族氨基酸的合成受支路的代谢产物苏氨酸的反馈抑制和蛋氨酸的反馈阻遏，为了提高苏氨酸和蛋氨酸的产量，对这一途径中的关键酶的酶催化机制进行研究、对蛋白结构进行定向改造已成为当前研究重点。本研究通过生物信息学和现代生物技术开展了Corynebacterium pekinense中HSD的特定氨基酸位点对HSD酶活力的影响机制的研究。1.通过BLAST序列比对发现，选择与北京帮杆菌HSD基因序列同源性为40%的Thiobacillus Denitrificans的晶体结构（3MTJ）为模板，利用modelling software Insight II97对北京帮杆菌HSD进行同源建模。利用PyMOL分析HSD的三维晶体结构及与活性位点相关的氨基酸残基，采用高级分子对接程序AutoDock Vina对HSD和底物进行分子对接，通过CLUSTALW序列比对，分析其保守性，最终确定对与活性中心K219具有极性作用的D215进行定点突变。2.构建HSDD215单突变体D215A、D215E、D215G、D215K，转入E. coliBL21中进行表达、纯化，并对比分析突变蛋白和野生型蛋白的酶动力学和酶学性质，结果表明：动力学拟合曲线显示WT与突变体D215A、D215E、D215G和D215K的Vmax分别为18.46U/mg、13.09U/mg、23.57U/mg、24.29U/mg、16.19U/mg；从动力学参数来看，突变体D215E和D215K表现出特有的动力学特征，两者具有较大的Vmax和较小的Km，较野生型具有较高的催化效率；突变体D215A较野生型与底物具有更好的亲和力；突变体D215G的n值接近于1，更趋向于米氏酶。WT与突变体D215A、D215E、D215G和D215K的最适反应温度分别为为37℃、37℃、40℃、35℃、37℃；最适反应pH分别为7.5、7.5、8.0、8.0、8.0；酶活半衰期分别为3.8h、5.38h、7.62h、2.58h和4.76h；5%的乙醇对四种突变体的酶活均具有激活作用。3.为进一步改善酶活，在本实验室已成功构建pET-L200F的基础上对D215进行定点突变，获得双突变体L200F-D215A、L200F-D215E、L200F-D215G、L200F-D215K，酶动力学结果表明：四个双突变体的Vmax分别为L200F的78.13%，97.88%，88.24%和124.39%；Km分别为L200F的80.58%，88.28%，81.50%和91.26%。选择催化效率最高的双突变体L200F/D215K进行酶学性质表征，结果表明：最适pH为7.5，最适温度为37℃；酶活半衰期为4.16h；1mmol/L的Mg2+对其酶活具有促进作用；对有机溶剂显示出较好的抗性。该实验为阐明HSD的酶活力影响机制和蛋白质半理性改造提供了一定的依据和参考。