【摘 要】
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本课题组前期对鸡的circGHR进行研究,发现其对鸡骨骼肌生长发育具有作用。为了深入挖掘circGHR的作用,本研究克隆了小鼠circGHR,分析了小鼠circGHR的序列信息和时空表达规律,构建了circGHR的带Flag标签蛋白载体验证circGHR的蛋白质编码能力,并在小鼠NCTC1469细胞和C2C12细胞中分析其作用。论文主要结果如下:（1）本研究发现小鼠GHR基因外显子2-8可以反向剪
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本课题组前期对鸡的circGHR进行研究,发现其对鸡骨骼肌生长发育具有作用。为了深入挖掘circGHR的作用,本研究克隆了小鼠circGHR,分析了小鼠circGHR的序列信息和时空表达规律,构建了circGHR的带Flag标签蛋白载体验证circGHR的蛋白质编码能力,并在小鼠NCTC1469细胞和C2C12细胞中分析其作用。论文主要结果如下:（1）本研究发现小鼠GHR基因外显子2-8可以反向剪接形成环状转录本,在成功克隆出circGHR,发现其具有RNase R耐受性,用随机引物反转录时效率更高,表明该分子为闭合环状结构。细胞亚定位结果显示circGHR主要存在于细胞核中。组织表达谱结果表明,circGHR在1周龄和7周龄小鼠的肺和肾组织中高表达,在心脏、腿肌和胸肌组织中低表达;GHR m RNA在1周龄小鼠肺中高表达,在7周龄小鼠肾中高表达,在1周龄和7周龄小鼠脾脏、胸肌和腿肌组织中低表达。（2）获得circGHR全长后,构建circGHR过表达载体和带Flag标签蛋白载体。在小鼠C2C12细胞中转染这两种载体后发现均能正常表达;使用Flag标签蛋白标记circGHR后,Western Blot试验可以检测到circGHR和Flag的融合蛋白,初步表明circGHR具有蛋白质编码能力。（3）在小鼠NCTC1469肝细胞中过表达circGHR后,通过q RT-PCR定量分析发现circGHR表达量极显著高于空载体组（P＜0.01）;GHR m RNA表达量显著高于空载体组（P＜0.05）;增殖标记基因CCND1和CDK2在12h表达量显著高于对照组（P＜0.05）,在24h-72h表达量显著低于对照组（P＜0.05）,且Edu12h结果显示在circGHR促进细胞增殖（P＜0.05）,12h后circGHR表达量与空载体组差异不显著（P＞0.05）。通过q RT-PCR和流式细胞术检测过表达circGHR对细胞凋亡的影响,结果显示凋亡标记基因Fas和Bax在48h-72h过表达组低于空载体组（P＜0.05）,流式细胞术检测细胞凋亡率同样显示36h-72h过表达组低于空载体组（P＞0.05）,表明circGHR有抑制NCTC1469细胞凋亡的趋势。（4）在小鼠C2C12成肌细胞中过表达circGHR后,q RT-PCR结果显示circGHR表达量极显著高于空载体组（P＜0.01）;GHR m RNA的表达量无显著差异（P＞0.05）;增殖标记基因CCND1在60h和72h表达量显著低于对照组,且CCK-8方法检测细胞增殖率,发现过表达组细胞活力低于空载体组,因此推断circGHR有抑制C2C12细胞增殖的趋势。但在其余时间点增殖标记基因的表达量在过表达和对照组间无显著差异（P＞0.05）,Edu试验结果显示过表达circGHR对C2C12细胞增殖无显著影响（P＞0.05）。用2%孕马血清诱导细胞分化后过表达circGHR,q RT-PCR结果显示circGHR能在细胞中过表达（P＜0.01）,GHR m RNA的表达量无显著差异（P＞0.05）,分化标记基因My HC的表达量和免疫荧光试验结果显示circGHR有促进细胞分化的趋势。但其余两个分化标记基因Myo G和My MK在组间表达量差异不显著（P＞0.05）。本研究发现小鼠circGHR具有明显的时空表达特异性,证实了circGHR是一个具有蛋白质编码潜能的环状RNA,在NCTC1469肝细胞中过表达circGHR后发现circGHR在12h对细胞增殖具有促进作用,在36h-72h有抑制细胞凋亡的趋势;在小鼠C2C12成肌细胞中过表达circGHR后发现circGHR有抑制细胞增殖和促进细胞分化的趋势。肝脏是动物体主要的代谢器官,对于动物的饲料利用率和营养吸收效率密切相关,而肌细胞能通过增殖分化形成肌纤维,进而影响动物骨骼肌的生长发育,通过研究circ RNA对肝细胞和成肌细胞的影响进而调控整个动物体的营养代谢与生长,同时本研究为后续深入挖掘circGHR分子的作用机制奠定了基础。
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