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T-2毒素是由镰饱菌产生的一类倍半萜烯类化合物,并且我国对虾饲料中存在普遍的污染,对虾饲喂了受T-2毒素污染的饲料以后,毒素会在对虾体内蓄积残留引起水产养殖业的潜在危险,毒素进一步通过食物链进入人体内,造成食物质量安全问题。前期课题组研究发现T-2毒素对对虾产生一系列危害,比如生产性能下降、消化系统损伤、解毒酶异常、免疫系统和抗氧化系统抑制以及肌肉品质降低等。而T-2毒素对生物大分子的研究比较少。生物大分子包括脂类、蛋白质、DNA和RNA。前期研究已发现T-2毒素对Ω-3不饱和脂肪酸的影响较大,采用差异蛋白质组学法发现了T-2毒素对精氨酸激酶产生较大影响,但是仅凭差异蛋白点的判断存在明显的证据不足,易造成较大误差,缺乏Westernblotting和RT-PCR实验数据佐证。而对于T-2毒素对对虾中的DNA和RNA鲜有报道。课题组前期用对虾体内的T-2毒素及其残留物处理RAW264.7细胞,采用RT-PCR方法探索了其对RAW264.7细胞内JAK/STAT信号通路关键因子mRNA表达量的影响。但是仅凭mRNA表达量的数据不能充分证明T-2毒素、隐蔽态T-2毒素和对虾体内的T-2毒素残留物对JAK/STAT信号通路关键细胞因子的影响,还缺乏Westernblotting实验数据佐证。因此,本研究根据毒理学设计原理,以对虾为研究对象,设定不同的T-2毒素剂量(0、1.2、2.4、4.8、12.2mg/kg·feed-1)的毒饵料,饲喂对虾,根据对虾体内精氨酸激酶、DNA、RNA、等各项指标的变化,进一步揭示T-2毒素对凡纳滨对虾的分子毒性作用。然后再根据对虾体内T-2毒素的残留物对小鼠RAW264.7细胞中JAK/STAT信号通路的家族成员的Westernblotting实验数据,提供对虾中T-2残留物的危害的分子毒性佐证。首先,对课题组前期通过差异蛋白组学发现的差异蛋白精氨酸激酶进行研究,利用OptimumAntigenTM工具进行抗体的设计,再通过Westernblotting检测技术检测不同剂量组染毒对虾体内精氨酸激酶表达量的变化,并对其差异蛋白点进行鉴定;再通过RT-PCR技术检测剂量组对虾体内精氨酸激酶mRNA的表达量变化,进一步对其差异蛋白点进行鉴定。结果发现,Westernblotting实验和RT-PCR实验的结果吻合,在低剂量组内精氨酸激酶表达量及mRNA表达量均降低,而在高剂量组升高,实验结果与差异蛋白组学的结果不符合。可能是对虾体内存在着精氨酸激酶的多种形式,比如说磷酸化过程中会形成磷酸化的精氨酸激酶,蛋白差异组学检测的是部分形式的精氨酸激酶,可能还有其他形式的精氨酸激酶未被蛋白差异组学发现,而Westernblotting实验和RT-PCR试验检测的是全部的精氨酸激酶mRNA表达量,因此实验结果存在差异。其次,本研究考察T-2毒素对DNA、RNA的损伤作用,以小牛胸腺DNA与T-2毒素作用,并通过单因素试验和响应面分析法,探究T-2毒素对DNA粘度以及在260nm处吸光度影响的最明显试验条件;提取空白组对虾DNA、RNA,按最佳实验条件,体外与T-2毒素作用,观察T-2毒素对对虾DNA粘度以及DNA、RNA在260nm处吸光度的影响;提取染毒剂量组对虾DNA、RNA,检测经过20d蓄积然后,不同剂量组染毒对虾体内DNA粘度以及DNA、RNA在260nm处吸光度的变化。结果发现T-2毒素对DNA粘度影响的最佳作用条件为:T-2毒素浓度2.70ng/μL;DNA浓度50μg/mL;反应时间T为43min;T-2毒素对DNA的OD260值影响的最佳作用条件为:T-2毒素浓0.70ng/μL;DNA浓度60μg/mL;反应时间T为30min;T-2毒素对对虾DNA粘度及OD260值的影响与小牛胸腺DNA具有相同的变化;在剂量组染毒对虾体内DNA粘度与体外实验结果具有相似性,整体粘度增加,但在2.4mg/kg剂量组DNA粘度明显低于空白组,而OD260值变化值并不相符合。T-2毒素对对虾RNA在260nm处的吸光度无影响。最后,提取12.2mg/kg.feed-1剂量组染毒对虾肝胰腺和肌肉体内隐蔽态T-2(mT-2s)与游离态T-2毒素以及T-2-GluA分别作用RAW264.7细胞24h,通过Westernblotting技术检测JAK/STAT信号通路中的细胞信号因子(JAK1-3和STAT1-3)的表达量变化,以及磷酸化(p-JAK1-3和p-STAT1-3)的影响。结果发现:游离T-2毒素和隐蔽态T-2毒素均等促进细胞信号因子过表达,同时能够促进信号因子的磷酸化,游离T-2的促进效果强于隐蔽态T-2。