我国“三北”及沿海地区有大量盐碱地。随着工业迅速发展、人口猛增和可耕地面积的减少，培育抗盐植物材料，开发利用盐碱地显得日益重要。 杨树为“三北”地区主要人工造林树种，栽培数量很大；猕猴桃为一新兴果树，经济价值较高。提高这2个树种抗盐性，扩大其栽培区域是开发利用盐碱地的有效途径，具有重要的生产意义。 本实验计划通过将mtlD/gutD双价耐盐基因导入杨树、猕猴桃，来提高这2个树种的抗盐能力。转化方法以叶盘法为主，辅助使用了基因枪法。所用植物双价双元表达载体为pBIMG，其上含有双价抗盐基因mtlD/gutD、双重增强的35S启动子和TMV“Ω”片段的翻译增强子及NPT-Ⅱ卡那霉素抗性标记基因，农杆菌菌株为LBA4404。杨树选用“三北”地区栽植数量较多的美洲黑杨×青杨杂种，猕猴桃选用经济价值较高的秦美猕猴桃。主要研究内容如下。 1利用正交等实验设计开展了杨树、猕猴桃叶片外植体高效再生系统建立研究。通过系统实验，筛选出杨树叶片外植体不定芽诱导最佳配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.01mg/L，不定芽生根诱导最适配方为1/2MS+NAA 0.01mg/L；猕猴桃叶片外植体不定芽诱导最佳配方为：MS+6-BA 6mg/L+NAA 0.1mg/L，不定芽生根诱导最适配方为：1/2MS+NAA 0.01mg/L+IBA 0.5mg/L+GA 1mg/L。 2通过卡那霉素敏感实验，确定了杨树叶片不定芽诱导卡那霉素临界敏感浓度为50mg/L，不定芽生根诱导卡那霉素临界敏感浓度为60mg/L；秦美猕猴桃叶片不定芽诱导卡那霉素临界敏感浓度为50mg/L，不定芽生根诱导卡那霉素临界敏感浓度为40mg/L。 3利用叶盘法开展了mtlD/gutD双价耐盐基因转化杨树的研究。经叶盘不定芽诱导及不定芽生根诱导阶段卡那霉素连续筛选，获得了38株生根卡那霉素抗性植株。抗性植株经PCR检测，28株呈阳性。对其中7株阳性植株进行southern及Western杂交，有4株二者均呈阳性，确证双价耐盐基因成功整合到杨树基因组中并得到表达；利用叶盘法和基因枪相结合的办法，开展了mtlD/gutD双价耐盐基因转化猕猴桃的研究。获得卡那霉素生根抗性植株20株，其中6株经PCR检测呈阳性，初步证明双价耐盐基因转化获得成功。 4开展了转基因植株耐盐性测定。结果表明，杨树未转基因植株NaCl最高耐受浓度为0.2％，4株转基因植株抗NaCl能力最低为0.4％，最高达0.6％，比对照有较大幅度提高；猕猴桃未转基因植株NaCl最高耐受浓度为0.1％，6株PCR阳性植株中，2株抗NaCl能力与对照一致(为0.1％)，推测为假阳性，另4株NaCl耐受浓度为0.2～0.4％，比对照有不同程度提高。2 milD／gutD双价耐盐基因转化杨树、猕猴桃的研究 本实验在建立了杨树、猕猴桃叶片外植体高效再生系统及确定了卡那霉素耐受浓度的基础上，利用叶盘法、叶盘法和基因枪相结合的办法分别开展了milD哈utD双价耐盐基因转化杨树和猕猴桃的研究。经PCR、Southern及Western杂交检测，确证milD哈utD双价耐盐基因成功整合到4株杨树基因组中并得到表达。同时，PCR检测也初步证明部分猕猴桃植株转化获得成功。耐盐测定表明转化植株耐盐性比对照均有不同程度提高。这在杨树、猕猴桃耐盐基因工程研究中尚属首次。