研究背景和目的心血管疾病是威胁人类健康的“头号杀手”,占疾病死亡原因的35%,而心肌梗死和心力衰竭是心血管疾病死亡的主要原因。心肌梗死是由于冠状动脉血管闭塞,导致心脏血液供应中断,形成以心肌细胞损伤、坏死为特征的疾病。心力衰竭是心肌细胞收缩和(或)舒张功能障碍,引起心输出量降低为特征的一类疾病。心肌梗死患者由于冠状动脉血管闭塞导致梗死区域内的心肌细胞坏死,周围缺血区域内的心肌细胞损伤,部分心肌细胞发生凋亡,从而造成有功能心肌细胞数目减少,由于心肌细胞缺乏必要的增殖分化能力,只能由成纤维细胞填充替代,形成瘢痕组织、心室壁变薄、室壁瘤形、心室重构、心脏收缩舒张功能减退、心电活动紊乱等原因,最终可导致患者死亡。目前实施的药物静脉溶栓治疗、冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路搭桥手术,心力衰竭再同步化治疗均无法使已经坏死或纤维化的心肌细胞恢复正常功能。心脏移植虽然是晚期心力衰竭最有效的方法,但是面临着供体器官短缺、医疗费用昂贵、手术要求高、自体免疫排斥反应等一系列的问题,因此,在临床实践过程中受到了很大限制。干细胞是一种未分化的多潜能细胞,具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能,干细胞移植治疗可以修复损伤坏死心肌细胞,为心血管疾病患者的治疗带来新的希望,如心肌梗死、心力衰竭、心肌病、完全性房室传导阻滞及病态窦房结综合症等患者。1981年Evnas和Martin研究小组首先建立了小鼠胚胎干细胞系,1998年Thomson和Shamblott研究小组分别利用人类体外受精囊胚和流产胎儿首次建立人类胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES)。随后一些研究发现人类胚胎干细胞可以被诱导分化为神经细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、造血细胞等200多种细胞。1999年Bjornson等将鼠中枢神经系统的神经干细胞横向分化为血细胞,进一步证明了成体干细胞同样具有横向分化潜能。根据干细胞的不同发育阶段,目前可将其划分为：①胚胎干细胞；②成体干细胞,包括造血干细胞、骨髓间质干细胞、肌肉干细胞、脂肪干细胞等。根据干细胞的分化潜能,又可将其划分为：①全能干细胞；②多能干细胞；③单能干细胞。胚胎干细胞和成体干细胞是干细胞移植治疗心血管疾病的两种候选细胞。胚胎干细胞为多潜能干细胞,可以分化为多种类型的心肌细胞,因受到伦理学问题的限制,目前仅限于动物实验。成体干细胞具有横向分化潜能,在一定条件下培养可以分化为心肌细胞。患者自身成体干细胞移植克服了免疫排斥反应和伦理学问题的争论,是干细胞移植治疗心血管疾病的种子细胞,但是,在临床应用过程中也面临着许多问题有待于进一步解决。细胞编程是将已分化成熟的体细胞在体外编程后,将其逆转为一种未分化状态,被逆转后的细胞具有多能性。细胞多能性是指其能够分化为机体内多种细胞类型的潜能。诱导性多潜能干细胞是近年来干细胞领域的研究热点。2006年8月日本京都大学Yamanaka研究小组首次将小鼠成纤维细胞诱导为多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS),简称"iPS细胞”。iPS细胞是将已分化成熟体细胞重编程为类似于胚胎干样细胞(Embryonic Stem Cells,ES)。iPS细胞不仅在细胞形态、表面抗原、基因表达、增殖及分化潜能方面类似于胚胎干细胞,而且,摆脱了围绕人类胚胎干细胞使用问题的政治和伦理争论,避免了患者异体干细胞移植引起的免疫排斥反应等优点,为干细胞移植治疗心血管疾病提供了新的思路和方法。建立iPS细胞大致包括以下主要环节：①选择体细胞及编程因子；②将编程因子转染入体细胞内；③体细胞的培养和编程；④iPS细胞的筛选；⑤iPS细胞的鉴定。2009年我国科学家利用四倍体囊胚注射法得到了iPS细胞来源的小鼠,首次证明了iPS细胞具有多向分化潜能。这一研究成果表明,iPS细胞可以分化为所有类型的心脏细胞,可用于心血管疾病的干细胞治疗。干细胞移植治疗心血管疾病的种子细胞应该具备以下特点：①来源充足,取材方便,易被患者接受；②移植后患者无自身免疫排斥反应,并具有良好的生物安全性；③无社会伦理学问题的争议。本实验首先,利用酶消化法原代培养UMC细胞,组织块贴壁法原代培HSF细胞。其次,以逆转录病毒介导系统作为外源性基因(Sox2、K1f4、Oct4、c-Myc)转移载体,将UMC细胞和HSF细胞体外诱导为iPS细胞。最后,对建立的iPS细胞系进行基因表达量检测、细胞核型分析、ES细胞特异性蛋白质检测、体内分化畸胎瘤、体外分化拟胚体等实验,对iPS细胞的生物学特性进行鉴定。研究方法1人诱导性多潜能干细胞的建立1.1原代培养UMC和HSF细胞手术切取正常新生儿脐带(1例)和急性心肌梗死患者皮肤(1例),利用酶消化法原代分离培养UMC细胞,组织块贴壁法原代分离培养HSF细胞。1.2制备CF-1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层选择一只孕13.5天CF-1小鼠,分离胚胎组织,用剪刀将其剪碎,利用0.15%胰酶消化15分钟,分离成纤维细胞。扩增原代培养的MEF细胞至P3代,应用10ug/ml浓度的丝裂霉素C工作液处理P3代细胞3小时。最后将新制备的MEF饲养层细胞进行冻存,以备日后应用。1.3包装生产逆转录病毒复苏冻存293T细胞,细胞生长密度达100%进行分盘,质粒转染前分盘后293T细胞生长密度应达到80%-85%左右。应用磷酸钙法将pMX-hOCT-4、pMX-hSOX-2、pMX-hKLF-4、pMX-hc-MYC、pMX-GFP及pCL包装质粒分别转染到293T细胞内,12-16小时更换培养液,包装生产携带外源性目的基因的逆转录病毒上清液,36-48小时收集病毒感染UMC和HSF细胞。1.4收集病毒感染UMC和HSF细胞复苏冻存UMC和HSF细胞,按4×104/每孔密度将UMC和HSF细胞分盘到六孔板中。收集包装生产逆转录病毒上清液,经0.45um滤过膜过滤,加入polybrene(8ug/ml)混匀,分别感染UMC和HSF细胞。1.5病毒感染后UMC和HSF细胞培养病毒感染第2天将细胞培养基更换为DFBS培养基,第6天将感染后的UMC和HSF细胞接种到MEF饲养层细胞培养,第18天将DFBS培养基更换为KSR培养基。1.6挑取iPS细胞克隆挑取iPS细胞克隆前一天,复苏MEF饲养层细胞到12孔板,第2天更换为KSR培养基。挑取iPS细胞克隆前,制作圆头和断口吸管,在显微镜下选取形态上类似于ES样的iPS细胞,应用圆头吸管切割细胞克隆,用断头吸管将切割好的细胞克隆吸出,移入铺有MEF饲养层的12孔板中1.7饲养层和无饲养层培养系统培养iPS细胞将被挑取的iPS细胞克隆接种到MEF饲养层细胞进行纯化和扩增培养。将在饲养层细胞培养的iPS细胞,再接种到无饲养层培养系统进行培养,提取iPS细胞DNA和RNA检测细胞基因表达量水平。2人诱导性多潜能干细胞的鉴定2.1基因表达量应用RT-PCR方法检测iPS细胞外源性基因Sox2、Klf4、 c-Myc和内源性基因Oct4、Rex1、Sox2的相对表达量。2.2外源性基因插入鉴定应用1%琼脂糖凝胶电泳法鉴定外源性基因Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc是否被插入到iPS细胞核内。2.3iPS细胞核型分析应用G显带核型分析法对iPS细胞进行核型分析,判断体细胞被重编程为iPS细胞后能否保持正常的细胞核型。2.4iPS细胞碱性磷酸酶(Alkaline phosphatasee, AP)染色检测iPS细胞碱性磷酸酶活性。2.5iPS细胞免疫荧光染色检测iPS细胞是否表达ES细胞特异性膜蛋白(SSEA3、SSEA4)、质蛋白(TRA-1-60、TRA-1-81)和核蛋白(Nanog)2.6Nanog、Oct4甲基化测序应用DNA甲基化测序法检测iPS细胞的Nanog、Oct4基因是否发生了去甲基化反应。2.7体内分化畸胎瘤实验将iPS细胞分别注射到SCID小鼠背部和大腿内侧,两个月后观察是否有畸胎瘤形成,并对形成的畸胎瘤实体进行组织切片苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining, HE)判断iPS细胞是否具有向三胚层组织细胞分化的潜能。2.8体外分化拟胚体实验iPS细胞在体外先悬浮培养形成拟胚体,然后进行贴壁扩增培养。裂解拟胚体细胞提取细胞RNA,应用RT-PCR方法检测内源性基因(Nanog、Oct-4)、内胚层基因(AFP、GATA4、SOX17)、中胚层基因(TBX1)、外胚层基因(PAX6、SOX1)的相对表达量。研究结果1iPS细胞的建立1.1原代培养UMC、HSF细胞利用酶消化法在体外成功分离培养出UMC细胞,应用皮肤组织块贴壁法在体外成功分离培养出HSF细胞。1.2制备MEF饲养层细胞应用丝裂霉素C处理P3代CF-1小鼠胚胎成纤维细胞3小时。镜下观察细胞形态未发生改变、细胞无大量死亡、细胞数量未增加,表明细胞在保持生存能力的同时,细胞增殖能力又受到了有效抑制。1.3包装生产逆转录病毒应用磷酸钙法成功的将外源性基因Sox2、Klf4、 Oct4、c-Myc转染到293T细胞内,293T细胞包装生产携带目的基因的逆转录病毒上清液。1.4收集病毒感染UMC和HSF细胞收集包装生产的逆转录病毒上清液分两次感染UMC和HSF细胞,体细胞成功的被携带目的基因的逆转录病毒上清液感染。1.5病毒感染后UMC和HSF细胞培养病毒感染细胞第4-5天,UMC和HSF细胞形态发生改变,呈类圆形,细胞发生聚集；第10-12天,在MEF饲养层细胞培养的UMC和HSF细胞出现iPS样细胞克隆增生；随着细胞培养时间的推移,iPS细胞克隆体积不断增大、边缘清晰,周围有较多杂细胞。1.6挑取iPS细胞克隆病毒感染第28-30天,在显微镜下分别挑取5株UMC和3株HSF细胞来源的iPS细胞克隆,分别命名为UMC-iPS-C1、 UMC-iPS-C2、UMC-iPS-C3、UMC-iPS-C4、UMC-iPS-C5、HSF-iPS-C1、 HSF-iPS-C2、HSF-iPS-C3。1.7饲养层和无饲养层培养系统培养iPS细胞iPS细胞生长状态良好,细胞呈球形,形态均一,克隆聚集成团,边缘整齐。在iPS细胞培养过程中,及时处理了已发生分化、衰老和死亡的iPS细胞。2iPS细胞的鉴定2.1iPS细胞基因相对表达量①iPS细胞内源性多能基因Nanog、Oct4、 Rex1、Sox2的相对表达量,明显高于编程前UMC和HSF细胞,并与ES细胞基因表达谱相类似。②外源性编程基因Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc在iPS细胞表达量明显低于病毒感染第6天的UMC和HSF细胞,其中,UMC-iPS-C2、 UMC-iPS-C3、HSF-iPS-C1、HSF-iPS-C3细胞克隆外源性基因沉默相对较好,被选入下一轮的iPS细胞鉴定实验。2.2外源性基因插入鉴定1%琼脂糖凝胶电泳检测结果阳性,表明外源性基因Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc被插入到iPS细胞核内。2.3iPS细胞核型分析G带核型分析结果显示,4株iPS细胞系均为46条染色体、XY型,细胞核型均正常。2.4AP染色①挑取iPS细胞克隆后,对剩余细胞进行AP染色,初步判断本次实验UMC和HSF细胞编程效率分别为1.84%和0.89%。②对在MEF饲养层细胞培养的iPS细胞进行AP染色,iPS细胞被染成深紫色为阳性；饲养层细胞和其它细胞被染色粉红色或没被染色为阴性。2.5ES细胞特异性蛋白质表达检测iPS细胞抗原抗体免疫荧光反应,膜蛋白(SSEA3、SSEA4)被染成紫蓝色,质蛋白(TRA-1-60、TRA-1-81),核蛋白(Nanog)被染成蓝绿色,细胞染色均为阳性,说明iPS细胞表达ES细胞特异性蛋白质。2.6Nanog、Oct4基因甲基化测序细胞编程前UMC和HSF细胞内源性基因Nanog、Oct-4处于甲基化状态,而细胞被编程为iPS细胞后,Nanog、Oct-4基因发生了去甲基化反应。2.7畸胎瘤实验及组织切片检查四株iPS细胞被注射到SCID小鼠体内均形成畸胎瘤实体,组织切片HE染色显示包含内胚层、中胚层、外胚层组织细胞。2.8拟胚体实验及基因相对表达量iPS细胞在体外悬浮培养,细胞聚集成团块状,形成拟胚体,再贴壁培养细胞团块。裂解细胞提取RNA, RT-PCR检测结果显示,内源性基因Nanog、Oct4表达量降低,内胚层基因(AFP、GATA4、 SOX17)、中胚层基因(TBX1)、外胚层基因(PAX6、SOXl)表达量发生明显差异。研究结论1以Oct-4、Sox-2、c-Myc、Klf-4作为编程基因,通过逆转录病毒介导的转基因技术,成功的将原代培养UMC和HSF细胞在体外诱导为iPS细胞。2对iPS细胞的生物学鉴定显示,细胞在形态学、基因相对表达量、碱性磷酸酶活性、ES细胞特异性蛋白质表达及细胞分化潜能等方面类似于ES细胞。