角膜不同保存方法与术后免疫排斥反应相关性的实验研究目的角膜病是当今世界主要的致盲性眼病之一，角膜移植手术是治疗角膜病患者脱盲最有效的方法。眼库及角膜保存技术是开展角膜移植的物质基础。但是目前角膜移植材料来源短缺及各地区材料分布不均匀，临床上往往不能满足角膜移植患者量多和应付急诊手术的要求，故对有限移植材料的保存日益受到人们的重视。所以，建立有效的眼库和深入研究角膜保存方法，延长角膜的生命活力，充分利用有限的角膜材料，随时为临床角膜移植提供优质供体材料是一个重要课题。基于短期保存方法对角膜材料保存时间的限制，如果能做到中长期活性材料的保存，将为角膜移植的开展起到关键的作用。角膜移植手术是治疗角膜病致盲的重要手段，术后角膜排斥反应是角膜移植手术失败的主要原因。角膜移植排斥反应是一个多因素参与，极其复杂和高度调节的过程。有关角膜移植的排斥反应的发生机制在许多环节上尚不清楚。如何将角膜移植的排斥反应降到最低限度已经成为国内外许多眼科学者的主要研究课题。本试验通过探索简易安全的中长期保存供体角膜的方法，采用大鼠角膜行中期保存液和深低温冷冻长期保存，来评价不同保存方法保存后角膜内皮细胞活性，研究其使用的可靠性，为临床能够提供更为满意优质的活性角膜供体材料及应用中长期保存材料行穿透性角膜移植奠定基础：旨在对不同方法保存的角膜行穿透性角膜移植后的观察，探讨角膜保存时间与术后排斥反应的关系，通过病理和免疫学方法定性和定量测定细胞因子和粘附分子(TNF-a和ICAM-1)的含量变化，并分析其原因，为提高角膜移植的成功率减少排斥反应的发生探索新的途径。方法1、建立简易中期保存液和微机监控程序降温的深低温保存法。将30只雌性成年健康清洁级Wistar鼠眼随机分为3组，应用不同保存方法保存大鼠角膜。分别为湿房保存组(Ⅰ组)、中期保存液保存组(Ⅱ组)和深低温保存组(Ⅲ组)。采用台盼蓝-茜素红染色对不同保存方法的角膜内皮细胞进行评价。判定3种不同保存方法的角膜内皮细胞的活性状态。2、建立大鼠穿透性角膜移植排斥反应动物模型。分别使用不同保存方法的Wistar鼠眼(实验一Ⅰ组)和角膜片(实验一Ⅱ组、Ⅲ组)作为供体，成年雌性健康清洁级SD大鼠作为受体，随机分3组。观察各组角膜移植术后免疫排斥反应指数(RI)、植片存活时间(MST)。标本行苏木素-伊红(HE)染色及免疫组织化学染色，观察植片的免疫排斥反应程度及炎症程度。采用酶联免疫吸附试验，检测各组大鼠角膜移植术后10天时房水、血清中肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的含量变化。结果1、经不同方法保存后的各组大鼠角膜内皮细胞密度及活性率相似。使用中期保存液保存组和深低温保存组后复温的角膜植片内皮细胞密度和活性率与湿房保存组比较差异无显著性(湿房组细胞密度2729.5±158.0个／mm~2，活性率ESR％为88.9％±3.5％；中期保存液保存组分别为2646.8+217.2个／mm~2和86.9％±2.7％；深低温保存组分别为2706.2±184个／mm~2和87.3％±3.3％，P＞0.05)。中长期保存角膜只要关键步骤合理，角膜内皮细胞密度并不随保存时间延长而明显下降，角膜内皮细胞的活性均在85％以上。2、异体湿房保存组(Ⅰ组)MST为10.4d±1.70d，异体中期保存液保存组(Ⅱ组)MST为12.9d±1.81d，异体深低温保存组(Ⅲ组)MST为16.1d±2.57d。异体深低温保存组MST明显延长，与其他两组比较均有显著性P＜0.01。Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组于术后10d时角膜植片水肿、混浊程度及新生血管范围依次减轻。角膜移植术后10d时HE染色显示Ⅲ组免疫排斥反应较轻微，单核细胞和淋巴细胞浸润和新生血管情况较Ⅰ组、Ⅱ组明显减轻，Ⅱ组较Ⅰ组明显减轻。免疫组化染色显示Ⅲ组ICAM-1表达较Ⅰ组、Ⅱ组明显减弱。Ⅲ组眶血清及房水中TNF-a含量为(213.76±19.06pg／mL，203.17±16.62 pg／mL)明显低于Ⅱ组(269.08±14.28pg／mL，240.87±9.28 pg／mL)和Ⅰ组(336.51±38.50pg／mL，284.83±28.76pg／mL)，差异有显著性P＜0.01。结论1、简易中期保存液和深低温保存后角膜具有较好的内皮细胞活性和临床应用价值。2、异体深低温保存组较异体中期保存组和异体湿房保存组角膜移植术后出现排斥反应的时间晚、发展慢且反应轻；异体中期保存组较异体湿房保存组角膜移植术后排斥反应降低，发生时间延长。ICAM-1和TNF-a是角膜移植排斥反应发生的重要因素之一，与排斥反应发生呈正相关。