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肠三叶因子(intestinal trefoil factot,ITF)是1991年发现的特异分布于胃肠道黏膜表面的小分子蛋白,它由59个氨基酸残基构成,分子量约6×103,属于三叶肽家族。ITF包含1个由38—39个氨基酸残基组成的特殊保守序列,其中的6个半胱氨酸按1~5,2~4,3~6的顺序依次形成3个二硫键,从而产生特异而稳定的三叶草型结构。该结构可确保ITF不受消化酶和pH变化的影响,有利于其在胃肠道中发挥生物效应,即维护肠黏膜的完整性,促进受损肠道修复。由于ITF具有特殊的空间结构,不仅能促进胃肠黏膜细胞增殖,还能同胃肠黏液中的糖蛋白结合,稳定胃肠黏液,维护胃肠黏液屏障,因而在减轻胃肠道损害,促进胃肠道修复方面具有重要意义。
乳酸菌是人和动物肠胃中正常存在的菌群,被公认为安全级微生物,已广泛地应用于食品及饮料加工业。乳酸菌作为基因工程表达菌株具有无内毒素安全性好、遗传背景清楚、表达效率高、表达蛋白不用纯化等优点。因此,乳酸菌表达系统逐渐受到重视和广泛应用。已有利用乳酸菌获得了医用的疫苗、抗原、酶、必需氨基酸等的高效表达的研究报道。如人干扰素β—2b(IFNα—2b)已成功的在德氏乳杆菌DM890表达,并且具有很好的抗病毒活性,用表达hCGβ的重组乳酸杆菌活疫苗经阴道黏膜途径免疫不同品系小鼠产生抗hCGβ免疫应答。
ITF对受损胃肠黏膜的疗效得到了肯定,大量动物实验证明,它是一种具有潜在药用价值的短肽,目前多采用基因工程的方法获取重组ITF。1999年国内有肠三叶因子在大肠杆菌中表达的报道,目前国内外也有酵母表达的报道。鉴于采用基因工程表达ITF产量低、活性差,ITF作为小肽存在纯化困难的问题,为此本研究利用乳酸乳球菌表达系统表达ITF。首先克隆hITFcDNA,构建hITF乳酸乳球菌分泌型表达载体,再转化乳酸乳球菌,获得稳定整合菌株,实现hITF在乳酸乳球菌中的表达,克服了纯化的困难,为乳酸乳球菌做为口服性药物的递送载体和ITF的深入研究奠定基础。