戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的急性病毒性肝炎，危害严重，目前尚无特异性防治手段，WHO已将HE疫苗推荐为21世纪最优先发展的疫苗之一。由于HEV主要经胃肠道传播，而口服疫苗不仅能够诱导全身性体液免疫和细胞免疫，还能诱导消化道的局部粘膜免疫，建立机体抗HEV的第一道防线，加上口服疫苗具有制备方便、安全性好、易于大规模接种等优点，因此研发HE口服疫苗具有良好的应用前景。 减毒沙门氏菌作为口服疫苗的载体，不仅能表达外源的蛋白抗原，而且可作为运送DNA疫苗的载体，应用广泛。我们在前期研究中，以含有HEV中和抗原表位的基因片段p179作为靶基因，与质粒pYA3341重组并转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550，成功构建了HE减毒鼠伤寒沙门氏菌活菌疫苗X4550（pYA3341-179），口服或鼻饲免疫均能诱导小鼠产生特异性体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫反应。然而，液体活菌疫苗稳定性较差，而冻干活菌疫苗能提高稳定性，便于疫苗的储存、运输和长期保存。肠溶性胶囊可避免胃液对口服疫苗的破坏，并使口服更加方便。因而本研究首先以X4550（pYA3341-179）液体剂型为基础，加入合适的冻干保护剂，经真空冷冻干燥工艺制备HE疫苗肠溶胶囊，并研究其稳定性；然后分别采用三种不同的免疫剂量和两种不同的免疫程序，研究HE口服疫苗肠溶胶囊在青紫蓝兔体内的安全性及免疫原性，确定优选的免疫策略，为HE口服疫苗的进一步研发奠定基础。 本研究分为三部分： 一、HE口服疫苗肠溶胶囊的制备及其稳定性的研究 首先对HE活菌疫苗X4550（pYA3341-179）的培养条件和生产工艺进行了研究，发现该菌按2×108CFU/ml接种入150ml新鲜培养基，培养12h后进入稳定期，OD600值在1．3左右，菌液pH值约7．8，活菌数达到最大值（8×1012CFU/ml），生长曲线特征明显，可获得最高产量；然后，分别采用Ⅰ型冻干保护剂（8％乳糖、1％明胶、5％脱脂奶、0．2％MgSO4·7H2O和1％谷氨酸钠）和Ⅱ型冻干保护剂（6％蔗糖、1％明胶、5％脱脂奶、2％甘油和0．4％L-半胱氨酸），经真空冷冻干燥工艺制备HE口服疫苗冻干粉，再加入辅料（2％硬脂酸镁、20％微晶纤维素、70％预胶化淀粉、8％低聚代羟丙基纤维素）搅匀后，手工灌装和套合胶囊，制成HE口服疫苗肠溶胶囊。通过对其冻干效果及冻干存活率等方面的研究，发现Ⅰ型冻干保护剂较Ⅱ型保护剂的冻干效果好，细菌存活率高。 采用上述胶囊制备方法，将培养的疫苗活菌沉淀与Ⅰ型冻干保护剂按不同比例（w：v为1：1、1：2、1：4、1：6、1：8或1：10）混合，冷冻干燥后制备了两者不同配比的疫苗胶囊。将胶囊分别于室温、4℃、-20℃和-70℃存放不同时间后检测胶囊内活菌数的变化，结果发现，以1：2配比制备的胶囊于室温存放2周，胶囊活菌数从1010 CFU下降到109 CFU；于4℃存放5个月，胶囊活菌数从1010 CFU下降到109 CFU；于-20℃和-70℃存放6个月，胶囊活菌数仍保持不变，较其他配比（1：1、1：4、1：6、1：8和1：10）制备的胶囊在不同温度存放时稳定性好，表明口服疫苗胶囊的稳定性除了与保存温度有关外还与冷冻干燥时冻干保护剂的用量有关。 此外，本实验分别采用菌落PCR、SDS-PAGE和western-blot的方法，研究了HE疫苗胶囊中重组菌X4550（pYA3341-179）所承载的重组质粒的稳定性及其蛋白表达的情况，结果显示胶囊中的重组菌能较好地保持重组质粒的稳定性，且能够正确表达目的蛋白p179。 二、HE口服疫苗肠溶胶囊的安全性研究 采用不同剂量（1010CFU/颗、108CFU/颗、106CFU/颗），以隔周免疫的方式口服免疫青紫蓝兔，同时设空胶囊对照组，通过监测青紫蓝兔的各项生理指标，找出疫苗接种剂量的安全范围。结果发现，各剂量疫苗组与对照组青紫蓝兔，均于首次免疫后出现了厌食、不活跃等现象，但3天后均恢复正常，生活状态也恢复良好。口服各剂量疫苗组与对照组青紫蓝兔的体重变化、肛温变化及生存状态等均无显著差别，表明青紫蓝兔能够耐受高至1010CFU剂量的疫苗菌。 采用不同免疫程序（隔天免疫或隔周免疫），以1010CFU的剂量口服免疫青紫蓝兔，通过监测青紫蓝兔的各项生理指标，找出安全合适的疫苗接种程序。结果发现，不同免疫程序组青紫蓝兔在首次免疫时出现了短暂厌食、不活跃等症状，但之后均恢复正常，生活状态恢复良好。两程序组青紫蓝兔的体重变化、肛温变化以及生存状态等均无显著性差异，青紫蓝兔对不同免疫程序疫苗组的耐受性均良好。 结果显示，在一定剂量范围内，HE口服疫苗肠溶胶囊隔周或隔天免疫均可以在青紫蓝兔体内获得较好的安全性。 三、HE口服疫苗肠溶胶囊的免疫原性研究 采用不同免疫剂量，以隔周免疫的方式口服免疫青紫蓝兔，均能诱导机体产生免疫应答反应。血清抗HEV-IgG水平和粪便抗HEV-sIgA水平的高低与免疫剂量有一定的相关性，均随免疫剂量的增加而增高，其中1010CFU口服组血清抗HEV-IgG和粪便抗HEV-sIgA显著高于106CFU口服组。因此，口服优选剂量取1010CFU。 采用隔天或隔周的不同免疫程序，以1010CFU剂量免疫时，两免疫程序组青紫蓝兔均能产生较强的免疫应答，血清抗HEV-IgG和粪便抗HEV-sIgA水平均随时间而逐渐升高。尽管隔天免疫组与隔周免疫组相比，抗体水平无显著性差异，但隔天免疫完成接种所需时间短，抗体产生较快，且诱导的免疫应答较高，因此免疫程序优选隔天免疫。 综上所述，本研究采用真空冷冻干燥工艺成功制备了HE口服疫苗肠溶胶囊，并采用不同的免疫剂量和不同的免疫程序口服免疫青紫蓝兔，结果表明该疫苗具有较好的安全性，且能诱导机体产生特异性体液免疫和粘膜免疫反应，值得做进一步的研究。