我国自1998年以来全面实施了 H9N2亚型禽流感病毒疫苗接种计划,但H9N2亚型禽流感仍是我国最流行的亚型。究其原因,H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)是单股负链RNA病毒,其本身的RNA聚合酶和逆转录酶缺乏严密的自我校正机制,导致病毒的核酸无法百分百的正确复制,突变的核苷酸经累积后可产生抗原变异,从而导致病毒发生免疫逃逸。在前期研究中,我们获得了有和没有抗体选择压下传代的抗原变异病毒,并发现抗体选择压可以推动H9N2 AIV HA基因发生抗原变异。为了 了解抗体选择压引起对H9N2 AIV抗原变异的氨基酸突变诱导宿主鸡产生特异性中和抗体的作用,本论文通过反向遗传学技术、血清学试验、实时荧光定量PCR以及动物试验等系统地鉴定了抗体选择压引起H9N2禽流感病毒抗原变异相关的氨基酸突变,并检测了其诱导的宿主特异性中和抗体。具体结果是:1.鸡胚模型传代病毒中与H9N2AIV抗原变异相关的HA基因氨基酸突变的鉴定在前期试验中,在有和没有抗体选择压的鸡胚中传代获得的抗原变异病毒HA基因发生了 4个氨基酸突变(K131R、S145N、G181E和A198V)。本论文以亲本病毒F/98(A198)株为骨架,我们通过反向遗传学技术共计拯救了 9株HA重组病毒:HA基因单突变病毒rF/HAK131R、rF/HAs145N、rF/HAG181E、rF/HAA198V和HA基因多突变病毒rF/HA348、rF/HA349、rF/HA389、rF/HA489和rF/HA3489。将9株HA基因突变病毒与亲本病毒F/98株进行抗原性分析,发现与F/98株相比,rF/HAK131R和rF/HAG181E病毒的HI效价没有发生改变,rF/HAs145N和 rF/HA348 病毒的 HI 效价下降 1.67 倍,rF/HAA198V、rF/HA349、rF/HA389、rF/HA489 和rF/HA3489病毒的HI效价下降5倍(HI效价相差4倍即可判定为抗原变异,△HI效价≥4倍),抗原变异十分明显。2.鸡模型传代病毒中与H9N2 AIV抗原变异相关的HA基因氨基酸突变的鉴定根据在有和没有抗体选择压的鸡宿主中传代获得的390株抗原变异病毒HA基因氨基酸序列,本论文以亲本病毒F/98株为骨架,通过反向遗传学技术共计拯救了 13株HA基因单突变病毒:rF/HAK131R、rF/HAQ133H、rF/HAQ164L、rF/HAA168T、rF/HAA198v、rF/HAM224K、rF/HAQ234L、rF/HAY264H、rF/HAG270R、rF/HAG274R、rF/HAK278E、rF/HAI386v 和 rF/HAK399N。将上述重组病毒与F/98株进行抗原性分析,发现单个A198V突变能导致病毒HI效价下降5倍(AHI效价>4倍),抗原变异十分明显;单个Q164L、A168T和M224K突变可引起病毒HI效价下降1.67倍;单个Q234L突变可引起病毒HI效价上升1.2倍;其余HA基因单个氨基酸突变不影响病毒的HI效价。微量中和试验(rF/HAA198v病毒和F/98株)及交叉HI 试验(rF/HAA198V(V198)、F/98(A198)、GD/SS/94(A198)和 JS/YZ618/12(T198))结果均充分证明,HA基因A198V突变可以引起病毒逃逸中和抗体反应,HA基因198位氨基酸是H9N2 AIV的抗原位点。3.抗体选择压对H9N2AIV与宿主细胞受体结合亲和力的影响受体结合亲和力是驱动流感病毒发生抗原漂移的重要因素。本论文通过RDE试验比较了鸡模型中有和没有抗体选择压下传代的20代病毒的受体结合亲和力的差异性。所研究的对象包括:亲本病毒F/98株、在没有抗体选择压的鸡宿主中传至20代的抗原变异病毒pF/NL(肺组织中分离纯化)、pF/NB(气管中分离纯化)和在有抗体选择压的宿主鸡中传至20代的抗原变异病毒pF/V(肺组织中分离纯化)、pF/VB(气管中分离纯化)以及20代抗原变异病毒HA基因单突变病毒rF/HAK131R、rF/HAA168bT、rF/HAA198v、rF/HAM224K和rF/HAQ234L。结果显示,亲本病毒F/98株的受体结合亲和力为6.25;pF/NL、pF/NB病毒的受体结合亲和力分别为50和167,pF/VL和pF/VB病毒的受体结合亲和力≥200,抗体选择压下传代的病毒的受体结合亲和力显著高于没有抗体选择压下传代的病毒。此外,rF/HAM224K病毒的受体结合亲和力为12.5,是F/98株的2倍,rF/HAA198v和rF/HAQ234L病毒受体结合亲和力≥200,是F/98株的32倍,HA基因A198V和Q234L突变显著地提高病毒与宿主细胞受体结合亲和力。4.有和没有抗体选择压下传代的抗原变异病毒诱导宿主鸡特异性中和抗体的差异性分析我们利用qPCR技术、HI试验和ELISA试验分别检测了在有和没有抗体选择压的宿主鸡肺组织中分离到的20代抗原变异病毒pF/NL和pF/VL在感染有和没有抗体选择压的宿主鸡后,宿主鸡的肺组织、脾脏和法氏囊中AID mRNA转录水平的差异和血清学变化。结果显示,有抗体选择压下传至20代的病毒pF/VL感染没有抗体选择压的宿主鸡后,在肺组织中诱导的AID mRNA转录水平更高,在脾脏中诱导的AID mRNA转录水平更低,在血清中产生的特异性中和抗体水平更低;有抗体选择压下传至20代的病毒pF/VL病毒感染有抗体选择压的宿主鸡后,在肺组织中诱导的AID mRNA转录水平更高,在法式囊中诱导的AID mRNA转录水平更低。在血清中产生的特异性中和抗体水平更高,且具有较强的抗病毒活性。此外,没有抗体选择压的宿主鸡在感染H9N2禽流感病毒后,肺组织和脾脏中的AID mRNA转录上调,法氏囊中AID mRNA转录水平下调,而有抗体选择压的宿主鸡感染H9N2禽流感病毒后,肺组织和脾脏中AID mRNA转录下调,法氏囊中AID mRNA转录水平上调。5.H9N2 AIV HA基因的A198V突变在诱导宿主天然免疫应答和特异性中和抗体中的作用为了阐明HA基因A198V突变逃逸中和抗体的分子机制,我们通过ELSIA试验检测HA基因A198V突变对病毒与特异性中和抗体结合力的影响,发现V198或A198均没有明显改变病毒与中和抗体的结合力,rF/HAA198v病毒受体结合亲和力的显著增强是病毒发生抗原变异的主要原因。另外,HA基因A198V突变不影响病毒的感染能力,在病毒感染初期可以抑制病毒的复制,而感染中后期可以增强病毒的复制。为了探讨HA基因A198V突变对宿主天然免疫应答的影响,我们分别检测了 HD11细胞和SPF鸡肺组织中天然免疫应答相关因子的mRNA转录水平。结果显示,HA基因A198V突变病毒在HD11细胞感染的后期可以诱导TLR3、TLR21和IFNβ mRNA更高水平的转录,在宿主鸡感染的中后期可以诱导肺组织中TLR3、TLR4、TLR7、MDA5和IFN-βmRNA更高水平的转录。另外,我们还通过qPCR技术、HI试验和ELISA试验分别检测了rF/HAA198V病毒和F/98株在感染有和没有抗体选择压的宿主鸡后,诱导宿主鸡肺组织、脾脏和法氏囊中AID mRNA转录水平差异和血清学变化,结果显示,没有抗体选择压的宿主鸡感染rF/HAA198v病毒后,肺组织和脾脏中的AID mRNA转录水平更高,血清中特异性结合病毒的IgG水平以及有效中和病毒的特异性抗体水平更低,但抗体的抗病毒活力更高;有抗体选择压的宿主鸡感染rF/HAA198V病毒后2-4d,肺组织、脾脏和法氏囊的AI[D mRNA转录水平更低,血清中产生的可以特异性结合病毒的IgG以及有效中和病毒的特异性抗体水平下调;感染后第7 d,肺组织和脾脏的AI[D mRNA转录水平更高。6.抗体选择压下产生的NA基因67-76位氨基酸缺失突变在诱导宿主天然免疫应答和特异性中和抗体中的作用H9N2 AIV F/98株在有和没有抗体选择压的宿主鸡中连续传代过程中,有抗体选择压下获得的抗原变异病毒均发生了 NA基因67-76位氨基酸缺失突变(NA△67-76),而没有抗体选择压下获得的抗原变异病毒的NA基因均未发生该缺失突变。由于该突变在野毒株中并未发现,因此本论文首次通过反向遗传学技术,以F/98株的7个基因为骨架,成功拯救了NA△67-76的NA重组病毒rF/NA△67-76,并通过一系列试验对NA△ 67-76突变株rF/NA△67-76的抗原性和生物学特性进行探索。具体结果是:rF/NA△67-76病毒的NA活性和受体结合亲和力均明显增强;rF/NA△67-76病毒在感染初期抑制了病毒的复制,在感染中后期增强了病毒的复制。此外,F/NA△67-76病毒具有一定组织嗜性,在气管中更容易复制。为了探讨NA△67-76对宿主天然免疫应答的影响,我们利用qPCR技术分别在HD11细胞和SPF鸡肺组织中检测了天然免疫应答相关因子的mRNA转录水平。结果显示,rF/NA△67-76病毒在感染HD11细胞的后期可以诱导更高水平的TLR4、TLR7、TLR21和NLRP3 mRNA的转录,在感染SPF鸡的中后期可以诱导肺组织中TLR2、TLR3、TLR7、TLR21和MDA5 mRNA更高水平的转录。我们还通过qPCR技术、HI试验和ELISA试验分别检测了 rF/NA△67-76病毒和F/98株在感染有和没有抗体选择压的宿主鸡后,诱导宿主鸡肺组织、脾脏和法氏囊中AID mRNA转录水平的差异和血清学变化,结果显示,没有抗体选择压的宿主鸡感染rF/NA△67-76病毒后可以在肺组织和脾脏中产生更高水平的AID mRNA转录,在血清中产生的特异性结合病毒的IgG水平以及有效中和病毒的特异性抗体水平更低,但抗体的抗病毒活力更高;有抗体选择压的宿主鸡感染rF/NA△67-76病毒后,在第2d,NA△67-76可以在宿主鸡肺组织中诱导更低水平的AID mRNA转录;感染后7d,在脾脏和法氏囊中诱导更高水平的AID mRNA转录;感染后第14 d,在法氏囊中诱导更低水平的AID mRNA转录;诱导血清中产生的特异性中和抗体水平下调。