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灵芝三萜酸为灵芝的关键药效成分。论文采用ITS序列对采自湖南本地的灵芝属2个新菌株进行了鉴定,检测了其抗肿瘤活性和主要三萜酸组份。在此基础上,开展三萜酸诱导发酵策略和技术,以及相关诱导机制分析研究。主要研究结果如下:1.两新菌株SCIM 1005和1006均被鉴定为灵芝属灵芝种Ganoderma lingzhi（东亚组）。通过发酵SCIM 1005和1006制备了灵芝菌丝体,经分析两菌株的菌丝体中氨基酸总量和必需氨基酸的量均高于已报道灵芝样品的相应含量。两菌株三萜酸提取物TAE-1和TAE-2中均至少含有6种活性三萜酸,含量最高的为灵芝酸T和灵芝酸Me。在体外TAE-1和TAE-2对S-180、SGC-7901、SMMC-7721和SW620等4类肿瘤细胞均具有显著细胞毒性,其中TAE-1对这4种肿瘤细胞生长的抑制IC50值分别为24.2、58.7、21.3和33.4μg/m L;TAE-2对应的IC50值分别为28.1、45.2、28.6和32.1μg/m L。TAE-1和TAE-2均对人正常肝细胞L-02的细胞毒性较小。小鼠体内实验表明,TAE-1对肉瘤180表现出剂量依赖性的抗肿瘤活性。TAE-1(250 mg kg-1)处理组小鼠肿瘤生长抑制率达46.6±4.6%,并可明显提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数值。2.利用Box-Benhnken设计并通过响应面法,研究初始p H、溶解氧（DO）和发酵温度三个变量之间的相互作用对灵芝中三萜酸产量和生产率的影响情况。研究表明,在5 L发酵罐中,三萜酸发酵过程中的最佳条件为初始p H 5.9、20.0%溶氧量和28.6℃,在此条件下对应的三萜酸的产率为308.1 mg/L。该最佳条件同样适用于200 L的发酵罐,获得的三萜酸的最大产量是未优化前三萜酸产量的1.8倍。3.研究了可诱导灵芝三萜酸合成的外源物质诱导策略、两阶段p H控制诱导策略,以及外源物质诱导整合两阶段p H控制策略。研究表明,连翘、蜣螂、金银花的乙醚提取物具有诱导灵芝三萜酸合成的作用,其中蜣螂乙醚提取物（EECM）的诱导作用最好。用补加EECM进行诱导发酵,灵芝的三萜酸产量可达302.76 mg/L,比对照组提高60%。进一步采用两阶段p H控制策略,使三萜酸的产率达到361.47 mg/L。随后采用中心组合设计（CCD）法整合优化外源物质诱导和两阶段p H控制策略。通过响应面优化,得到当EECM的补加浓度为185.89 mg/L,在发酵初始72 h内p H值控制为5.07,72 h后控制为4.37时,可获得诱导优化后的三萜酸产量达449.37 mg/L,是原对照组三萜酸产量的2.37倍。此外,本项诱导优化策略还成功应用于150 L发酵罐的中试试验,在中试条件下,可获得三萜酸产量431.83 mg/L。4.从发酵动力学的角度,利用Sigmoid模型对比研究了添加9,10-环甲基十七烷酸（9,10-CMA）前后灵芝深层发酵产三萜酸的动态变化特征。研究显示,灵芝对照组中三萜酸在4～9 d大量合成,并于第9 d达到最大值（268.62 mg/L）;添加9,10-CMA组中三萜酸的合成量于第8d时达到最大值（343.52 mg/L）。添加9,10-CMA后,灵芝菌丝体细胞对底物葡萄糖的利用速度加快,细胞比生长速率在3.2 d达到最大值(μmax),为0.94d-1,显著高于对照组的0.88 d-1（在第3.4 d获得）;葡萄糖比消耗速率在第1.7d达到最大值(qS,max),为8.34 d-1,显著高于对照组的6.80 d-1（在第2.1d获得）。胞内三萜酸比合成速率显著提高,在第6.2 d达到最大值(qIPS,max)13.76 d-1,是对照组9.66 d-1的1.42倍。两组中灵芝三萜酸的合成与细胞生长均呈现部分偶联关系,添加9,10-CMA后,没有改变细胞生长和三萜酸合成在发酵过程中的相互关系。5.在9,10-CMA诱导下,NO可作为信号分子参与灵芝菌丝体中苯丙氨酸解氨酶（PAL）活化、三萜合成关键酶细胞色素CYP450的生成和三萜酸合成。NO可以作为触发灵芝菌丝体细胞中PAL活化和CYP450产生的有效条件。NO虽然是苯丙氨酸代谢途径中的上游分子,但并不是唯一的信号分子。在灵芝菌丝体细胞中除了NO以外还存在其他信号分子或者信号途径共同介导9,10-CMA对PAL活性和CYP450含量的促进作用。由此可见,NO可作为PAL活化和灵芝三萜合成关键酶CYP450产生的上游分子起作用,它是9,10-CMA诱导菌丝体细胞中PAL活化和CYP450产生的信号转导途径中所必定存在、但不是唯一的信号分子而存在着的。6.分析了9,10-CMA诱导下灵芝三萜酸合成的8个关键酶的基因动态表达。在9,10-CMA诱导下,与灵芝三萜酸合成相关的3‐羟基‐3‐甲基戊二酰辅酶A还原酶基因hmgr、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因mvd、细胞色素P450单加氧酶CYP5150L8基因、法尼基焦磷酸合酶基因fps、鲨烯合酶基因sqs5等5个基因的表达显著上调,表明这5个相应酶可能是在9,10-CMA诱导过程中起更关键作用的三萜合成酶。论文鉴定了灵芝属新菌株,提出了灵芝三萜酸发酵合成新策略,揭示了9,10-CMA对灵芝三萜酸生物合成的诱导机制,为灵芝三萜酸合成代谢和代谢调控提供了重要理论参考,同时所获得的诱导优化策略和技术也可为灵芝三萜酸的高效定向生产提供实践指导。