论文部分内容阅读
目的: 构建钙网织蛋白(calreticulin，CRT)基因的短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)质粒载体，应用本实验室现存的CRT重组腺病毒载体，分别上调和下调乳腺癌细胞系MDA-MB-231中钙网织蛋白的表达。观察对MDA-MB-231细胞增殖的影响，诱导凋亡的效应及侵袭能力的改变，并初步探讨其可能机制。 方法: 设计并合成针对CRT基因的shRNA链，退火形成双链，与酶切的质粒pGPU6/GFP连接，构建重组质粒，转化DH5a菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。实验分为空白对照组、质粒pGPU6/GFP空载体组、下调组和上调组。采用实时定量PCR法(Real time-PCR，RT-PCR)检测各组细胞CRT基因的表达情况;Western blot法检测各组细胞CRT蛋白的表达情况;MTT法检测各处理因素对细胞增殖能力的影响;Annexin Ⅴ-PE/7-AAD双染流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;Transwell法检测各处理因素对细胞侵袭能力的影响。 结果: 本研究成功构建了真核质粒载体pGPU6-CRTshRNA，并成功导入到乳腺癌MDA-MB-231细胞系中，RT-PCR检测CRTmRNA表达和Westernblot检测CRT蛋白表达均已得到证实。MTT法检测细胞增殖能力，pGPU6-CRTshRNA明显抑制MDA-MB-231细胞的增殖，其余对照组无明显作用。AnnexinⅤ-PE/7-AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡情况结果显示，pGPU6-CRTshRNA组与对照组相比能促进细胞的凋亡率。Transwell法检测细胞侵袭能力结果显示，pGPU6-CRTshRNA组明显抑制细胞的侵袭能力，穿过小室细胞数目明显减少。 结论: 下调乳腺癌细胞系MDA-MB-231中CRT的表达，明显抑制细胞的增殖能力，促进细胞的凋亡并且抑制细胞的侵袭能力，而上调细胞中的CRT的表达并没有对细胞的以上行为有明显的改变。