α-酮戊二酸脱羧酶依赖辅因子TPP和二价金属离子的激活催化α-酮戊二酸非氧化脱羧生成琥珀酸半醛和CO2。该酶是蓝藻体内KGD旁路代谢途径中的关键酶。本研究将铜绿微囊藻来源的编码α-酮戊二酸脱羧酶的MAE＿06010和Mi Abw＿01735基因与分子伴侣p Tf16形成共表达体系,并将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行诱导表达。通过镍亲和层析方法纯化得到大量可溶性蛋白,采用酶标仪和酶偶联法对其进行了动力学表征以及催化功能鉴定,同时还检测了α-酮戊二酸脱羧酶的底物特异性。结果表明MAE＿06010蛋白和Mi Abw＿01735蛋白同时具有α-酮戊二酸脱羧酶和乙酰乳酸合酶功能,但是乙酰乳酸合酶的活性仅为α-酮戊二酸脱羧酶的1/200。α-酮戊二酸脱羧酶的生化表征结果显示该酶的最适p H为7.0,最适反应温度为40℃,Mg2+和Mn2+对其激活效果最佳,且对α-酮戊二酸具有底物特异性。MAE＿06010蛋白对底物α-酮戊二酸的Km值为0.87±0.23 mmol/L,kcat为7.8 s-1;对辅因子TPP的Km值为0.0056±0.0007 mmol/L,kcat为2.9 s-1。而Mi Abw＿01735蛋白与底物α-酮戊二酸的Km和kcat分别是4.47±2.63 mmol/L和4.3 s-1,与辅因子TPP的Km和kcat分别是0.026±0.006 mmol/L和3.2 s-1。本研究通过对MAE＿06010蛋白进行多序列比对以及同源建模,找到了辅因子TPP附近的氨基酸残基并对其进行了定点突变,纯化得到突变体蛋白对其进行动力学表征。研究结果表明,几乎所有突变氨基酸残基都影响了该酶对TPP的结合,其中D435残基参与底物α-酮戊二酸的结合以及作为酸碱催化剂影响酶促反应过程;L467、M410、Y465、D462残基参与了底物α-酮戊二酸的结合;M410残基还对TPP的“V”构型起到了支撑作用;E50残基催化TPP形成叶立德的过程;D462残基作为电子中介参与催化过程。最后,根据突变研究结果和同族其他酮酸脱羧酶的研究,推断出α-酮戊二酸脱羧酶可能的催化机制,TPP在E50残基的作用下去质子形成叶立德结构,然后对底物进攻生成CO2和烯胺中间体。D462残基行使质子供体和受体的作用去质子化,最后形成产物琥珀酸半醛。