【摘 要】
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二氨基庚二酸脱羧酶（DAPDC）是PLP依赖型脱羧酶,特异性对二氨基庚二酸的D-立体中心的羧基进行脱羧作用,生成赖氨酸。本研究以蓝杆藻ATCC51142基因组为模板,PCR扩增获得cce1351基因,构建了pET28a-cce1351表达载体,转化进大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。进行诱导表达和纯化后,通过偶联酵母氨酸脱氢酶验证了cce1351蛋白具有二氨基庚二酸脱羧酶的功能,并对cce13
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二氨基庚二酸脱羧酶（DAPDC）是PLP依赖型脱羧酶,特异性对二氨基庚二酸的D-立体中心的羧基进行脱羧作用,生成赖氨酸。本研究以蓝杆藻ATCC51142基因组为模板,PCR扩增获得cce1351基因,构建了pET28a-cce1351表达载体,转化进大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。进行诱导表达和纯化后,通过偶联酵母氨酸脱氢酶验证了cce1351蛋白具有二氨基庚二酸脱羧酶的功能,并对cce1351蛋白进行了生化表征。二氨基庚二酸脱羧酶的酶促反应的最适温度为30℃,且温度越低,二氨基庚二酸脱羧酶的稳定性越好。二氨基庚二酸脱羧酶的酶促反应的最适pH为8.0,且在pH为8.0的缓冲液中稳定性最佳。常见金属离子中Mg2+、Ca2+对二氨基庚二酸脱羧酶有激活作用,Mg2+的激活作用最强,Mn2+、Ni2+、Zn2+、Co2+则对二氨基庚二酸脱羧酶活性有抑制作用,Co2+的抑制作用最强,金属离子螯合剂EDTA与Cu2+对二氨基庚二酸脱羧酶活性没有表现出抑制或激活作用,可知二氨基庚二酸脱羧酶催化反应过程不需要添加金属离子。二氨基庚二酸脱羧酶对底物二氨基庚二酸的结合常数KM为1.198 mmol/L,催化常数kcat为1.681s-1,kcat/KM值为1.403 L/（mol·s）。通过生物信息学技术找出二氨基庚二酸脱羧酶活性中心位于DAP和PLP附近的氨基酸残基,通过定点突变技术对其进行定点突变,纯化突变体蛋白后进行酶动力学表征。结果表明Asp118能将辅因子维持在质子化的形式,Leu375、His204、Ser249与DAP的识别有关,Tyr428、Gly286、Gly330参与催化反应。最后根据突变体蛋白酶动力学表征结果和已解析的二氨基庚二酸脱羧酶晶体结构,推断二氨基庚二酸脱羧酶的催化机理。本研究为赖氨酸的生物合成方案打开新思路,也为开发抑菌药物奠定了基础。
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