胃癌居我国恶性肿瘤发病率的第2位、死亡率的第3位,预后很差。由于其自身的发展规律和特点,几乎全部的胃癌患者在确诊时已经发生腹膜种植转移或术后很快出现腹膜种植转移形成腹膜癌。有针对性的预防与治疗胃癌腹膜种植转移对提高胃癌患者的生存质量、改善患者的预后具有重要意义。近年来研究表明：腹腔热灌注化疗对预防与治疗胃癌腹膜种植转移具有较好的疗效,但其确切的机理尚缺乏深入的研究。由于肿瘤细胞的耐热性远不如正常细胞,因此热灌注化疗可以通过高温和增强肿瘤细胞的药物敏感性更有效的清除肿瘤细胞,其中自噬在热灌注诱导肿瘤凋亡中有重要作用。研究表明,在不同的条件下,自噬既可能促进肿瘤细胞的死亡,也可能促进肿瘤细胞的存活。当受到理化因素伤害时,如耐受放射治疗,化疗打击等,肿瘤细胞可以通过提高基础自噬水平,耐受更强的外界损伤因素,修复肿瘤细胞的损伤；但是,如果诱导细胞过度自噬,则能够促进肿瘤细胞发生自噬性死亡,从而达到治疗肿瘤的目的。目前,在临床上经典的自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)已经尝试用于多种肿瘤的治疗,并取得一定的疗效。因此,近年来认为诱导肿瘤自噬性死亡可能是肿瘤治疗的重要策略之一。研究表明活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)能够诱导自噬分子Beclin1与Bcl-2解离,从而激活Beclin 1诱导自噬通路,使mTOR受到抑制,使得自噬标志物LC3 Ⅱ表达量升高,进而启动细胞自噬相关的信号通路诱导细胞自噬性死亡。最新研究发现：温热化疗能够促进肿瘤细胞内产生氧化应激反应,提高肿瘤细胞内的ROS水平；温热化疗配合氧化应激诱导剂t-BOOH,能增加细胞内ROS水平,提高对肿瘤细胞的杀伤作用。温热化疗刺激肿瘤细胞高表达ROS,诱导肿瘤细胞凋亡,可能是温热化疗抗肿瘤的重要机制之一综上所述,本课题提出以下假设：温热化疗可能通过促进肿瘤细胞内产生氧化应激反应,提高肿瘤细胞内的ROS水平,从而诱导胃癌细胞自噬性死亡,可能是温热化疗抗肿瘤的重要机制之一。为验证该假设,项目在细胞学实验及动物模型两个层面进行研究,首先模拟温热化疗条件,研究产生ROS产生与胃癌细胞自噬基因表达的相关性,然后探讨温热化疗刺激胃癌细胞产生ROS在自噬性死亡中的作用；进一步探讨ROS诱导胃癌细胞自噬性死亡在温热化疗杀伤胃癌细胞中的作用。课题的完成将为腹腔热灌注化疗对预防与治疗胃癌腹膜种植转移的机制提供新的思路。研究目的1.研究温热化疗刺激胃癌细胞产生ROS与胃癌细胞自噬基因表达的相关性；2.探讨温热化疗刺激胃癌细胞产生ROS在诱导胃癌细胞自噬性死亡中的作用；3.探讨ROS诱导胃癌细胞自噬性死亡在温热化疗杀伤胃癌细胞中的作用。材料和方法一、细胞实验水平检测1.1奥沙利铂药物浓度筛选：人胃癌细胞SGC-7901进入指数生长期后,用不同浓度的奥沙利铂(L-OHP) (10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160 μg/ml和320μg/ml)处理SGC-7901细胞,24 h后通过MTS法测定各组细胞活力,以IC50为标准确定奥沙利铂的工作浓度。1.2热疗温度筛选：确定奥沙利铂工作浓度之后,用工作浓度的奥沙利铂处理SGC-7901细胞1小时后,分别将细胞置于39℃、41℃、42℃、43℃、45℃的恒温水浴锅中处理1小时,再接着培养24小时,通过MTS法检测细胞活力,根据实际情况确定对细胞具有较强杀伤效果的温度。1.3细胞分组处理：待奥沙利铂工作浓度与热疗温度确定后,将SGC-7901细胞分为四组：(1)空白对照组(2)热疗组(3)化疗组(奥沙利铂)(4)温热化疗组。其中空白对照组予37℃处理,不给予化疗药物奥沙利铂处理；化疗组给予工作浓度的奥沙利铂药物处理;热疗组给予1.2中确定的热疗温度的温热处理；温热化疗组给予奥沙利铂药物处理同时给予1.2中确定的温度热疗。各组细胞处理1h后继续培养24 h后进行以下检测：1.3.1流式细胞仪检测各组细胞ROS的产生量；1.3.2流式细胞仪检测各组细胞线粒体膜电位；1.3.3通过MTS法检测各组细胞活力；1.3.4流式双染检测各组细胞的凋亡情况；1.3.5通过western blot检测自噬相关基因Beclin 1、LC3B和mTOR的蛋白表达情况；1.3.6通过光学显微镜观察各组细胞形态变化,透射电镜观察各组细胞自噬体形成。二、动物实验水平检测2.1选取实验动物SPF级BALB/C-NU(4-6周龄,体质量18～22 g)裸鼠,在裸鼠腹股沟区一侧皮下建立SGC-7901细胞裸鼠移植瘤模型。将12只裸鼠模型随机分为4组(n=3),分别为：①control组；②热疗组(43℃,腹腔注射与L-OHP等量的葡萄糖)③常温化疗组(6mg/kg L-OHP腹腔注射给药)④温热化疗组(6mg/kg L-OHP腹腔注射给药后1h,将需要热疗的实验鼠长有肿瘤的腹股沟区浸入事先装有已经预热到需要温度的温水小鼠盒,水的深度保持在小鼠直立时能保证肿瘤能浸在水中,将小鼠盒放入设定好同样温度的生化培养温箱中,温热处理1.5 h,保证肿瘤内部的细胞也能受热1小时)。2.2各组实验处理24 h后断椎处死,取手术切除的新鲜肿瘤组织,一部分制成细胞悬液,流式细胞仪检测各个样品的ROS产生量;一部分组织做免疫组化检测自噬相关基因Beclin 1、LC3和mTOR蛋白的含量;TUNEL检测肿瘤组织的细胞凋亡情况。2.3实验结果以采用origin6.0和SPSS20.0统计软件进行分析,连续型数据以均值±标准差表示,多组间比较用单因素方差分析,多重比较采用LSD方法；析因设计资料采用析因方差分析,以P<0.05为有统计学意义。结果一、L-OHP药物化疗与热疗对细胞的抑制具有协同作用1.1 L-OHP对人胃癌细胞SGC-7901的活力的抑制作用与浓度呈正相关MTS法检测细胞活力的结果显示：不同浓度的L-OHP对SGC-7901细胞的活力均具有抑制作用,并且随着L-OHP药物浓度的增加,对细胞活力的抑制作用也随之增加。统计结果表明八组细胞活力有统计学差异(F=1598.325,P=0.000),不同浓度细胞的活力两两比较均不同(P<0.05)。根据MTS检测细胞活力的结果,计算出细胞在不同浓度L-OHP药物处理下的增值率和抑制率,得到L-OHP药物的IC50为80.66μg/ml,因此采用L-OHP的工作浓度为80 μg/ml进行后续实验。1.2热疗对细胞活力有抑制作用,并随着热疗温度的升高一直作用增强为了研究热疗对SGC-7901细胞活力的作用效果,我们用不同的温度处理不加药物的SGC-7901细胞,设定的温度梯度为37℃、39℃、41℃、42℃、43℃、45℃,并同时用根据1.1.1中选出的L-OHP药物浓度80 μg/ml在不同的温度下处理细胞1 h,然后继续培养细胞24 h,通过MTS法检测各组细胞的活力。结果表明SGC-7901细胞的活力随着温度的增加而下降,说明温热对细胞具有杀伤作用。并且统计结果表明细胞受奥沙利铂和温度抑制作用的交互效应有统计学意义(F=78.00,P=0.000),奥沙利铂和温度的主效应也均有统计学差异(F=25201.956,P=0.000；F=993.630,P=0.000),同时我们通过金正均法分析药物化疗与温热作用对细胞的抑制是否具有协同作用,结果显示：当温度达到41度后,化疗与热疗开始具有协同作用,由于临床应用时必须考虑病人对温度的耐受性,根据实际情况确定热疗温度为43℃。1.3 L-OHP药物化疗与热疗协同抑制细胞增殖根据前面的检测分析的结果,我们选取了L-OHP药物浓度80μg/ml和热疗温度43℃,按前面的细胞分组方法处理各组细胞,MTS检测结果显示,热疗组、化疗组和温热化疗组的细胞活力与control组相比,细胞活力均有明显下降(p<0.05),其中以温热化疗组细胞活力降低最为显著(p<0.01)。统计结果表明细胞受奥沙利铂和温度抑制作用的交互效应有统计学意义(F=80.948,P=0.000),奥沙利铂和温度的主效应也均有统计学差异(F=5827.421,P=0.000；F=968.003,P=0.000),同时用金正均法计算奥沙利铂与加热的联合作用的效果,得出增效q值为1.370,说明L-OHP药物化疗与热疗对细胞活性的抑制具有协同作用。另外,通过倒置显微镜观察细胞生长状态发现,与control组相比,热疗组和常温化疗组细胞密度明显降低,且细胞趋向变圆,其中温热化疗组细胞生长最慢,大量细胞变圆且漂浮在培养液中,死亡的细胞数最多。二、L-OHP药物化疗与温热化疗对细胞的杀伤作用与细胞内过量的ROS产生和细胞的自噬相关2.1 L-OHP药物化疗与温热化疗促进细胞产生过量的ROS流式细胞仪检测各组细胞内ROS水平得到,与control组细胞相比,单独的热疗处理或者化疗处理细胞,以及同时温热化疗处理都能引起细胞内ROS的表达量上升(p<0.05),并且结果表明同时对细胞进行温热处理,促进细胞内ROS增加的效应最为明显(p<0.01)。统计结果表明细胞受奥沙利铂和温度抑制作用的交互效应无统计学意义(F=3.006,P=0.118),奥沙利铂和温度的主效应也均有统计学差异(F=1837.156,P=0.000;F=42.392,P=0.000),与前期工作中MTS检测细胞活力的结果一致。2.2 L-OHP药物化疗和温热化疗能使细胞线粒体膜电位降低流式细胞仪检测各组细胞线粒体膜电位的变化,结果显示：与control组相比,对细胞进行单独的热疗或者化疗,以及同时对细胞热疗和化疗处理都能引起细胞线粒体膜电位的下降,其中化疗和热疗联合处理组细胞的线粒体膜电位下降程度达到最高水平(p<0.01),统计结果表明细胞受奥沙利铂和温度抑制作用的交互效应有统计学意义(F=70.039,P=0.000),奥沙利铂和温度的主效应也均有统计学差异(F=1248.867,P=0.000；F=774.044,P=0.000)。2.3 L-OHP药物化疗和热疗处理细胞能促进细胞凋亡流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,结果显示：单独的热疗对细胞凋亡促进效果不明显,只是降低了细胞活性,说明单独的热疗对细胞的杀伤作用相对较弱,而L-OHP药物处理组的细胞和温热化疗处理组的细胞都发生了细胞凋亡数量显著的增加(p<0.01),还是以温热化疗对细胞的杀伤作用为最强,统计结果表明细胞受奥沙利铂和温度抑制作用的交互效应有统计学意义(F=388.733,P=0.000),奥沙利铂和温度的主效应也均有统计学差异(F=13553.926,P=0.000；F=402.304,P=0.000)。2.4 L-OHP药物化疗与热疗可以引发细胞的自噬性死亡为了进一步研究热疗和化疗诱导的细胞凋亡是否与自噬相关,我们通过透射电镜分别观察各组细胞内自噬小体的形成,结果显示：化疗组和温热化疗组细胞内都出现染色质固缩和自噬小体增加的现象,并且温热化疗组细胞细胞内出现大量空泡状结构和自噬小体,说明L-OHP药物化疗与热疗对SGC-7901细胞的杀伤作用与自噬相关。2.5温热化疗能够促进自噬相关基因的表达Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3B、Beclin1、mTOR的变化,结果显示：化疗组和温热化疗组的自噬相关的LC3B、Beclin1蛋白表达有了显著的上升,而雷帕霉素靶蛋白mTOR的表达量与自噬程度呈负相关,表明化疗组和温热化疗组的细胞中自噬相关蛋白LC3由Ⅰ型转化为Ⅱ型的活性形式,Beclinl的表达量也有显著上升,而雷帕霉素靶蛋白mTOR在自噬发生的细胞中表达量下降,进一步证明温热化疗引发的细胞死亡与自噬相关,统计结果表明细胞受奥沙利铂和温度抑制作用的交互效应有统计学意义,奥沙利铂和温度的主效应也均有统计学差异。三、动物肿瘤模型证明温热化疗能够引发肿瘤细胞的自噬性死亡3.1胃癌实验动物模型方法的建立结果表明,将5×106个活细胞皮下注射接种到裸鼠腹股沟区皮下,可以建立人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤模型。3.2温热化疗促进肿瘤细胞内ROS的产生流式细胞仪检测各组细胞内ROS水平得到,结果表明,与control组细胞相比,热疗、化疗和温热化疗均能显著增加肿瘤细胞中ROS的含量,统计结果表明细胞受奥沙利铂和温度抑制作用的交互效应无统计学意义(F=4.573,P=0.065),奥沙利铂和温度的主效应也均有统计学差异(F=34.687,P=0.000;F=116.970,P=0.000)。3.3温热化疗促进肿瘤细胞自噬相关基因的表达和细胞死亡Western blot和免疫组化实验方法验证肿瘤组织细胞中自噬相关基因的表达与定位。结果发现,经过热疗、化疗与温热化疗处理的各组肿瘤组织细胞的自噬相关蛋白LC3B、Beclin1、mTOR的表达量与细胞层面的结果一致,另外统计结果表明细胞受奥沙利铂和温度抑制作用的交互效应有统计学意义,奥沙利铂和温度的主效应也均有统计学差异。TUNEL法检测各组肿瘤组织细胞凋亡情况,结果发现,热疗、化疗与温热化疗处理都能促进肿瘤组织细胞的凋亡水平增加。结论1.胃癌细胞产生ROS可使胃癌细胞自噬相关基因m-TOR表达下调,Beclin 1、LC3B表达上调,胃癌细胞ROS产生水平与胃癌细胞的自噬水平呈正相关；2.温热化疗诱导胃癌细胞ROS产生水平与杀伤胃癌细胞的效应呈线性关系,表明温热化疗刺激胃癌细胞产生ROS在诱导胃癌细胞自噬性死亡中起重要作用；3.温热化疗刺激胃癌细胞产生ROS诱导的胃癌细胞自噬性死亡在温热化疗杀伤胃癌细胞中起重要作用;