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研究背景和目的:肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是一种发病率和致死率均较高的肝脏原发性恶性肿瘤。肿瘤微环境与HCC增殖和自噬的关系密切,一方面,微环境性细胞自噬能够通过释放谷氨酰胺等氨基酸促进HCC生长;另一方面,微环境因素介导的肝癌细胞非自主性自噬能够为HCC提供增殖必需的氧化底物。由于癌细胞比非癌细胞更依赖于自噬,我们重点关注HCC非自主性自噬在肝癌中的作用。研究发现,自噬在肝癌的不同阶段发挥不同的作用,在早期能够抑制肝癌的发生,在进展期,HCC非自主性自噬具有促进肝癌增殖生长的作用。肿瘤相关成纤维细胞（Cancer Associated Fibroblasts,CAF）是肝癌肿瘤微环境中的重要细胞组分之一,与肝癌的增殖生长以及预后密切相关。然而,CAF对肝癌细胞的促增殖作用与HCC非自主性自噬的关系尚不清楚。前期预实验研究发现CAF能够促进肝癌的增殖生长,且其促增殖生长作用与肝癌细胞自噬有关。本研究旨在探究处于活化状态的CAF调控HCC非自主性自噬促进肝癌细胞增殖和肿瘤生长的可能机制,为以靶向肿瘤微环境CAF和肝癌细胞自噬的治疗措施提供新的思路和方向。研究方法:1.采用原代细胞培养技术分离提取人原代肝癌CAF和癌旁PAF并予以鉴定。为探究活化的CAF对肝癌细胞增殖的影响和可能机制,采用原代CAF条件培养基（Conditioned Medium,CM）刺激肝癌细胞,以PAF、人肝星状细胞系LX-2和人滑膜成纤维细胞系HFL的CM处理组做为对照,平板克隆形成实验、细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit 8,CCK8）实验比较分析活化状态的CAF CM对肝癌细胞增殖和生存能力的影响;以单纯接种Hep G2细胞裸鼠成瘤组为对照,共同接种CAF与Hep G2细胞的裸鼠成瘤实验结合转录组测序分析并探究CAF在体内促进肝癌生长的可能机制。实验中发现肝癌细胞自噬介导CAF对肝癌细胞增殖效应的调控,通过使用自噬阻断剂抑制肝癌细胞自噬后,采用蛋白免疫印迹（Western Blot）、实时定量聚合酶链反应（Real-time Polymerase Chain Reaction,Real-time PCR）、免疫荧光共聚焦、透射电镜等实验手段分析CAF CM是否能够通过诱导肝癌细胞自噬发挥促肝癌增殖功能。2.为探究活化状态的CAF对肝癌细胞自噬的调控是否依赖于分泌型GDF15与肝癌细胞膜受体GFRAL的相互作用,通过文献和生物信息学分析,以及对人原代肝癌CAF与癌旁PAF的转录组测序分析发现生长分化因子15（Growth Differentiation Factor 15,GDF15）是CAF与PAF表达差异最显著的基因;采用慢病毒转染稳定敲低CAF GDF15表达后,通过裸鼠成瘤以及蛋白免疫印记、Real-time PCR、免疫组织化学染色等实验手段分析CAF对肝癌细胞自噬和增殖功能的促进作用是否部分依赖于GDF15的旁分泌;通过生物信息学以及转录组测序分析筛选肝癌细胞中与GDF15相互作用的目标蛋白,胶质细胞源性神经营养因子家族受体α（GDNF family receptor alpha-like,GFRAL）,采用裸鼠皮下荷瘤模型以及免疫荧光、免疫组化、Western Blot以及流式细胞学等实验手段分GDF15/GFRAL信号轴介导活化CAF对肝癌细胞自噬和增殖的调控作用。结果:1.平板克隆形成实验、CCK8细胞活力实验以及裸鼠成瘤实验表明,与PAF、人肝星状细胞系LX-2和人滑膜成纤维细胞系HFL相比,活化状态的CAF能够明显促进肝癌细胞的增殖和存活能力。2.蛋白免疫印记、Real-time PCR、免疫荧光、透射电镜实验结果表明CAF能够诱导肝癌细胞自噬的发生。3.自噬阻断剂抑制肝癌细胞自噬后,CAF CM对肝癌细胞的促增殖和存活能力减弱。4.蛋白免疫印记、Real-time PCR结果表明活化的肝癌CAF可通过旁分泌GDF15调控肝癌细胞自噬。5.平板克隆形成、CCK8以及裸鼠成瘤实验表明,敲低CAF GDF15表达后减弱了CAF对肝癌细胞的促增殖存活能力。6.蛋白免疫印记、流式细胞术结果表明GFRAL能够介导对肝癌细胞自噬的调控。7.CCK8实验表明敲低肝癌细胞GFRAL表达后抑制了GDF15对肝癌细胞的保护作用。结论:1.活化的CAF可通过诱导肝癌细胞自噬促进肝癌增殖。2.GDF15作用于肝癌细胞受体GFRAL参与活化的CAF对肝癌细胞自噬的调控。