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目的:伴随着非酒精性脂肪性肝病（Non alcoholic fatty liver disease,NAFLD）发病率的逐年攀升,随之而来的是终末期肝病数量的全球性飙升。人们迫切需要有效的治疗方法遏制住这种近乎势不可挡的疾病,而现阶段针对NAFLD的治疗方案非常局限,因此从多维角度更好地理解NAFLD的发病机制,进一步找出预防和治疗NAFLD的新靶点至关重要。维生素D作为体内的一种脂溶性维生素,人们越来越认识到它骨骼肌之外的作用,这其中就包括对NAFLD的积极治疗作用。肠道菌群是人体第二个“基因库”,由于“肠-肝轴”的纽带作用使得肠道菌群在NAFLD的发病过程中发挥着独特作用,靶向肠道菌群,合理利用肠道菌群至少可以通过减轻炎症反应,增强能量代谢,竞争黏附位点等方面改变NAFLD的结局。细胞焦亡作为一种细胞的程序性死亡方式,它是机体的天然免疫反应,近年来被人们所重视,一方面由激活的炎症反应清除宿主体内的病原体,另一方面如果发生过度的细胞焦亡,将募集大量的炎症反应,这种情况下势必导致正常细胞死亡,组织受损,甚至出现器官衰竭等致命损伤。本研究拟通过在体内实验中应用维生素D干预高脂饲养大鼠,观察其肠道菌群及代谢组学变化,并观察对脂代谢的影响,以及可能参与调节的炎症信号因子的变化,之后收集高脂维生素D干预组大鼠粪便制备粪菌液,予下一批高脂饲养大鼠灌肠,观察对脂代谢的影响;体外实验应用维生素D干预BRL-3A细胞,观察维生素D对脂毒性大鼠肝细胞BRL-3A保护作用,以及可能参与的信号通路因子的变化,从而探讨维生素D对脂毒性的保护作用及其可能的分子机制,为NAFLD的治疗提供新的靶点及研究策略。本研究分为如下三部分进行:第一部分:维生素D对NAFLD大鼠肠道菌群、代谢组学的影响,维生素D对NAFLD大鼠脂代谢影响的研究。第二部分:维生素D对脂毒性大鼠BRL-3A细胞保护作用的研究。第三部分:维生素D通过抑制细胞焦亡对NAFLD的影响作用的机制研究。研究方法:1、将SD大鼠分为普通饲养及高脂饲养,高脂饲养组给予不同剂量的1,25（OH）2D3,按照1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg每周2次腹腔注射,观察体重、Lee’s指数、肝湿重、肝指数等。全自动生化分析仪测定各组大鼠肝功酶学、血脂、血清葡萄糖。2、HE染色联合油红O染色,观察各组大鼠肝脏脂肪变性及镜下脂滴含量。3、16S r DNA测序分析各组大鼠肠道菌群构成,筛选高脂维生素D最佳剂量干预组与高脂组做代谢组学分析比较。4、透射电镜比较各组肝脏组织细胞焦亡发生情况。5、免疫组化方法检测各组大鼠肝脏组织NLRP3蛋白表达情况。6、Western blot方法检测各组大鼠肝脏NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleavedcaspased-1、pro-IL-1β、IL-1β、GSDMD-N蛋白水平。7、酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）比较各组大鼠血清IL-1β及IL-18水平。8、筛选出高脂饲养组最佳1,25（OH）2D3干预组,收集粪便,制备粪菌液,予下一批高脂大鼠灌肠,观察体重、Lee’s指数、肝湿重、肝指数等。全自动生化分析仪测定各组大鼠肝功、血脂、血清葡萄糖。9、体外培养BRL-3A细胞,按1,25（OH）2D3的不同浓度10-6M、10-7M、10-8M处理细胞,根据油红O染色检测各组细胞脂滴含量,试剂盒法检测各组细胞甘油三酯（triglyceride,TG）,细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8,CCK-8）法检测各组细胞增殖活力,筛选出一个最佳的1,25（OH）2D3的作用浓度进行后续实验。10、试剂盒法检测各组细胞乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）。11、Western blot方法测定各组细胞NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleavedcaspased-1、pro IL-1β、IL-1β、GSDMD-N蛋白水平。12、免疫荧光法验证各组细胞上NLRP3蛋白的表达。13、BRL-3A转染GSDMD-N,转染后Western blot方法验证GSDMD-N蛋白表达水平。14、BRL-3A细胞过表达GSDMD-N后,应用油红O染色检测各组细胞脂滴含量,试剂盒法检测各组细胞TG,CCK-8法检测各组细胞增殖活力,验证过表达GSDMD-N促进细胞焦亡是否可以逆转维生素D带来的减轻脂质积累的作用。结果:1、普通饲养组大鼠与高脂饲养组大鼠体重、Lee’s指数、肝指数对比均存在明显差异。但经过5μg/kg、10μg/kg的1,25（OH）2D3 biw干预后的大鼠Lee’s指数较普通高脂饲养组大鼠明显改善。经过5μg/kg的1,25（OH）2D3biw干预后大鼠血清肝功、血脂及血清葡萄糖均较普通高脂组明显下降。2、经过5μg/kg的1,25（OH）2D3biw干预后大鼠肝脏脂肪变性及脂滴含量在所有高脂饲养组中最轻。3、16S r DNA测序结果提示经过5μg/kg的1,25（OH）2D3biw干预后的高脂大鼠肠道菌群与对照组最为接近,乳酸菌属水平明显增高,代谢组学发现与普通高脂饲养组差异代谢产物百余种。4、透射电镜提示经过5μg/kg的1,25（OH）2D3biw干预后的高脂大鼠肝脏细胞焦亡程度可减轻。5、免疫组化结果提示经过5μg/kg的1,25（OH）2D3biw干预后可减少高脂大鼠肝脏表达NLRP3水平。6、Western blot结果显示经过5μg/kg的1,25（OH）2D3biw干预后可减少高脂大鼠肝脏表达NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1、pro IL-1β、IL-1β、GSDMD-N的蛋白水平。7、ELISA结果显示经过5μg/kg的1,25（OH）2D3biw干预后可减少IL-1β及IL-18水平。8、应用HFD+1,25（OH）2D3（5μg/kg）组大鼠粪便予下一批高脂大鼠灌肠,可以降低高脂大鼠体重,减轻脂毒性的影响。9、按照10-6M、10-7M、10-8M不同浓度的1,25（OH）2D3处理细胞,油红O染色及TG试剂盒检测均提示浓度为10-6M干预后细胞脂滴含量减少最明显,TG下降最多,应用10-6M的浓度可以提升细胞增殖活力。10、应用1,25（OH）2D3干预体外NAFLD细胞模型可使LDH下降。11、Western blot结果显示应用1,25（OH）2D3干预体外NAFLD细胞模型可以使NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1、IL-1β、GSDMD-N的表达下降。12、免疫荧光结果显示应用1,25（OH）2D3干预体外NAFLD细胞模型可以使NLRP3表达下降。13、BRL-3A质粒转染GSDMD-N,应用Western blot方法证实GSDMD-N蛋白成功过表达。14、BRL-3A细胞过表达GSDMD-N后,即使有1,25（OH）2D3的干预,CCK8提示细胞增殖活力下降,油红O染色提示细胞内脂滴含量无明显下降,TG测定结果提示TG下降不理想,提示虽然1,25（OH）2D3对脂毒性BRL-3A细胞有保护作用,但过表达GSDMD-N条件下这种有益作用将被逆转。结论:1、在体内实验中,经过5μg/kg的1,25（OH）2D3biw干预的高脂大鼠其脂毒性可减轻,炎症因子表达减少,细胞焦亡发生程度减轻。2、经过5μg/kg的1,25（OH）2D3biw干预后的高脂大鼠肠道菌群与对照组最为接近,乳酸菌属水平明显增高,代谢组学发现与普通高脂饲养组差异代谢产物百余种。3、应用HFD+1,25（OH）2D3（5μg/kg）组大鼠粪便予下一批高脂大鼠灌肠,可以降低高脂饲养大鼠体重,减轻脂毒性的影响。4、在体外实验中,1,25（OH）2D3具有保护BRL-3A细胞脂毒性的作用,减轻细胞焦亡的发生。5、体外实验中过表达GSDMD-N促进细胞焦亡可以逆转维生素D带来的减轻脂质积累的有益作用。