第一部分iPSCs的建立以及多巴胺能神经元、星形胶质细胞的诱导目的:诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)具备多向分化潜能,能够诱导分化成包括多巴胺能神经元、星形胶质细胞在内的多种终末功能细胞,是进行帕金森病发病机理研究的可靠模型。本课题取人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),通过仙台病毒导入四种转录因子,将其重编程为具有多向分化潜能的iPSCs,并将其诱导分化为多巴胺能神经元(dopaminergic neurons,DA neurons),建立帕金森疾病模型。同时将iPSCs诱导成为星形胶质细胞(astrocytes),研究星形胶质细胞对人类帕金森模型中的多巴胺能神经元的保护性作用。方法:将健康人外周血单个核细胞PBMCs以5x10^5/孔密度铺板,用仙台病毒感染试剂盒将四种转录因子(Oct3/4,Sox2,c-Myc和Klf4)导入细胞。每天换PBMCs培养基,并观察细胞的聚集现象。在转染第三天将其重铺板并换成iPSCs培养基。每天换液,观察到陆续有小克隆出现,并逐渐长大。克隆长至一周左右挑选至灭活的小鼠胚胎成纤维细胞上培养,继续每天换液至克隆长大,选择边缘光滑、未分化的克隆,用机械划割和挑选方法传代。继续根据现有文献的方法并加以改进,利用一系列生长因子以及小分子化合物顺序作用于iPSCs,将其诱导分化为多巴胺能神经元、星形胶质细胞。结果:(1)成纤维细胞感染仙台病毒并重新铺板后,第3天出现小克隆,并逐渐长大;(2)第4～5代的iPSCs用碱性磷酸酶(ALP)染色呈深紫色阳性结果,表明得到的克隆具有干细胞多向分化的特征;(3)免疫荧光染色检测多能干细胞的特异性标记物TRA1-60,OCT3,Nanog,SOX2,SSEA4,结果显示得到的iPSCs高表达干细胞特异性标记物;(4)运用流式细胞技术flow cytometry进一步检测干细胞标记物(SSEA4,TRA1-81),结果证实得到的iPSCs表达这两种干细胞标记物;(5)利用免疫荧光鉴定多巴胺能神经元。共聚焦荧光显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope)检测到高表达的神经元标记物 Neuron-specific Class Ⅲ β-tubulin(TuJ1)和多巴胺能神经元特异性标记物Tyrosine hydroxylase(TH);(6)免疫荧光鉴定星形胶质细胞。共聚焦荧光显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope)检测到分化得到的细胞表达星形胶质细胞特异性标记物GFAP和S100β。结论:将四种因子(Oct3/4,Sox2,c-Myc和Klf4)导入体细胞能有效地将血液中的单个核细胞重编程得到具有多向分化潜能的诱导性多能干细胞iPSCs,其具有胚胎干细胞的特异性标记物。iPSCs能在一系列生长因子和小分子化合物的作用下诱导分化成为多巴胺能神经元和星形胶质细胞。得到的细胞分别具有多巴胺能神经元和星形胶质细胞的特异性标记物。第二部分星形胶质细胞通过向帕金森模型中的多巴胺能神经元输送健康线粒体修复其受损的有氧呼吸目的:线粒体是细胞的能量中枢,其功能的成熟与稳定是维持细胞正常生理状态的必要条件。线粒体功能障碍是帕金森病的重要发病机制之一。星形胶质细胞是哺乳动物脑内含量颇丰的细胞群体,其对神经元的支持作用已得到广泛的研究和证实。有研究表明,星形胶质细胞对多巴胺能神经元的分化和生存具有支持作用。本课题利用iPSCs分化得到的多巴胺能神经元建立帕金森模型,将其与星形胶质细胞共同培养,观察星形胶质细胞是否对帕金森病中的多巴胺能神经元具有保护性作用,并探究保护性作用的发生机制。方法:用神经毒素鱼藤酮处理iPSCs分化得到的多巴胺能神经元,建立帕金森病模型,并将星形胶质细胞以1:1 比例铺板到帕金森模型中的多巴胺能神经元上。利用免疫荧光技术观察、测量并比较共培养组和单纯鱼藤酮处理组,神经元突触的长度。将线粒体绿色荧光染料标记的星形胶质细胞与无线粒体荧光染料标记的多巴胺能神经元共培养,24小时后利用免疫荧光技术观察在神经元胞体内是否有绿色荧光标记的线粒体。将线粒体绿色荧光标记的星形胶质细胞和细胞红色荧光标记的多巴胺能神经元共培养,利用流式细胞仪技术Flow cytometer检测分别带有绿色荧光、红色荧光以及两种荧光的细胞群。将星形胶质细胞铺板在cell culture insert培养皿上培养,并放入种有多巴胺能经元的12孔板里,培养之后利用CCK8和celltiter试剂盒检测多巴胺能神经元活性和胞内ATP水平。结果:(1)免疫荧光观察TH 阳性的多巴胺能神经元,鱼藤酮组神经元突触明显短于正常组,而鱼藤酮处理过的多巴胺能神经元与星形胶质细胞共培养之后,突触显著变长。(2)线粒体绿色荧光标记的星形胶质细胞与鱼藤酮处理的多巴胺能神经元共培养24小时后,免疫荧光观察到在多巴胺能神经元胞体内存在绿色荧光标记的线粒体,说明星形胶质细胞内的线粒体穿梭到多巴胺能神经元内。(3)将线粒体绿色荧光标记的星形胶质细胞和细胞红色荧光标记的多巴胺能神经元共培养后,利用流式细胞分析技术flow cytometry检测到共培养的细胞群内有同时带有绿色荧光和红色荧光的细胞群,再次验证了两种细胞共培养后发生了线粒体穿梭。(4)利用孔径大小为1.Oum的cell culture insert构建共培养系统。设置四个组别:对照组、共培养组、鱼藤酮处理组、鱼藤酮处理后共培养组,并利用试剂盒Cell Counting Kit-8(CCK8)检测细胞活性,结果显示单纯共培养组细胞活性较健康对照组无明显改变,鱼藤酮处理组胞活性较健康对照组明显降低,而鱼藤酮处理后共培养组细胞活性较鱼藤酮组显著上升。(5)检测四个组别细胞内ATP含量得出,单纯共培养组细胞活性较健康对照组上升,鱼藤酮处理组胞内ATP含量下降,而与星形胶质细胞共培养过后胞内ATP含量明显升高。(6)利用孔径大小为0.4um的cell culture insert构建共培养系统。四个组别分别为:对照组、共培养组、鱼藤酮处理组、鱼藤酮处理后共培养组。结果显示鱼藤酮组细胞活性较健康对照组明显下降,而共培养后细胞活性与鱼藤酮组没有明显统计学差异。(7)Cell Titer试剂盒检测四个组别的胞内ATP含量。鱼藤酮组细胞内ATP含量较健康对照组明显下降,而共培养后细胞内ATP含量与鱼藤酮组的胞内ATP含量没有明显改变。结论:鱼藤酮处理的多巴胺能神经元突触长度明显降低,而其与星形胶质细胞共培养后神经元突触长度显著增加。提示星形胶质细胞对帕金森病模型中的多巴胺能神经元具有保护性作用。免疫荧光和流式细胞技术结果说明两种细胞共培养后,星形胶质细胞的线粒体穿梭到多巴胺能神经元中。当0.4um孔径的cell culture insert阻隔了星形胶质细胞的线粒体进入神经元培养基,而允许生长因子、营养因子等小分子在两种细胞培养基中自由出入,星形胶质细胞对多巴胺能神经元的保护性作用消失。提示星形胶质细胞对多巴胺能神经元的保护性作用通过线粒体穿梭实现,而非其分泌的生长因子、营养因子等的作用。第三部分:鱼藤酮通过激活p38 MAPK信号通路促进神经元对线粒体的摄入目的:有研究表明,细胞间线粒体穿梭现象存在于多种疾病模型中,传输的健康线粒体能够重建疾病细胞受损的呼吸功能,对受体细胞起到保护性作用。而线粒体穿梭的机制也在多种疾病模型中得以研究及阐述。本部分旨在阐明,在我们的星形胶质细胞与多巴胺能神经元共培养模型中,调节线粒体穿梭的机制。方法:将标记有线粒体绿色荧光蛋白的星形胶质细胞与鱼藤酮处理的多巴胺能神经元共培养,24小时后固定、染色,利用免疫荧光方法观察绿色荧光标记的线粒体、多巴胺能神经元特异性蛋白TH、细胞骨架蛋白phalloidin;收集星形胶质细胞的培养基并离心去除细胞碎片和杂质,得到星形胶质细胞条件性培养基(astrocyte-derived conditioned medium,ACM)。将培养基超速离心后去除线粒体,并通过滤膜,得到去除线粒体的条件性培养基(mitochondria-depleted ACM,dmACM)。利用流式细胞技术检测培养基中是否存在线粒体。用JC1染料检测星形胶质细胞条件性培养基ACM和去除线粒体培养基dmACM内的线粒体膜电位。利用02 sensor kit检测并比较星形胶质细胞条件性培养基ACM和去除线粒体培养基dmACM内的氧气消耗量。收集星形胶质细胞条件性培养基替代星形胶质细胞,用于培养鱼藤酮处理的神经元,继而用CCK8 Kit和Cell titer kit检测各组的细胞活性和胞内ATP含量。Western blot技术检测帕金森模型中的多巴胺能神经元内MIRO1、TNFaIP2、p-p38的蛋白含量。鱼藤酮模型中加入p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580后,western blotting技术检测p-p38的的蛋白含量,并利用CCK8试剂盒检测,p38 MAPK信号通路抑制后,星形胶质细胞条件性培养基ACM培养鱼藤酮模型后神经元的活性。将神经元用p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580处理后,用细胞红色荧光蛋白标记,并与线粒体绿色荧光蛋白标记的星形胶质细胞共培养后,利用细胞流式技术检测同时标记有绿色和红色荧光蛋白的细胞群。神经元用SB203580处理后,与标记了线粒体绿色荧光蛋白的星形胶质细胞共培养24小时,并固定、染色,制作玻片,并用激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope)观察绿色荧光标记的线粒体是否出现在神经元胞体内。结果:(1)利用激光共聚焦激光显微镜观察共培养体系中细胞骨架蛋白,TH阳性多巴胺能神经元以及线粒体绿色荧光蛋白,没有观察到神经元和星形胶质细胞间存在沟通胞间联系的纳米管隧道结构(intercellular tunnelling nanotubes,TNT);(2)细胞流式技术检测培养基ACM以及去除线粒体的培养基dmACM中的线粒体,结果显示ACM中线粒体颗粒明显较dmACM中的多;(3)JC1测量并比较条件性培养基(ACM)和去除线粒体的培养基(dmACM)中线粒体的膜电位,结果提示ACM中线粒体的膜电位高于dmACM;(4)检测并比较ACM和dmACM实时氧耗量,结果显示ACM氧耗量高于dmACM;(5)鱼藤酮处理的神经元分别用ACM和dmACM培养后,检测细胞活性,结果显示鱼藤酮处理降低神经元活性后,ACM能显著提升细胞活性,而dmACM培养对细胞活性没有明显改善;(6)利用Cell titer kit检测上述组别中胞内ATP含量,结果显示鱼藤酮处理后神经元内ATP含量降低,ACM培养能显著提高神经元胞内ATP,而dmACM对胞内ATP没有提升作用;(7)western bloting检测鱼藤酮模型中,神经元胞内三个与线粒体转移相关的蛋白含量。结果显示MIRO1和TNFaIP2水平在鱼藤酮模型中没有明显改变,而p-p38水平明显增高;(8)p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580作用于鱼藤酮模型后,p-p38水平降低;(9)SB203580处理鱼藤酮模型后,加入ACM培养神经元,CCK8检测到神经元的活性没有显著增高;(10)SB203580处理神经元鱼藤酮模型后,标记上细胞红色荧光蛋白,并与标记有线粒体绿色荧光蛋白的星形胶质细胞共培养,利用流式细胞技术检测得出,同时带有红色与绿色荧光标记的细胞群比例(7.53%)较未经SB203580处理组(16.818%)明显降低,其差异具有统计学意义。(11)SB203580处理鱼藤酮模型后,与标记有线粒体绿色荧光蛋白的星形胶质细胞共培养,制作玻片后利用激光共聚焦显微镜观察,神经元胞体内绿色荧光线粒体较未经SB203580处理组明显减少。结论:健康星形胶质细胞的线粒体通过释放到培养基内,被帕金森模型中的多巴胺能神经元摄取,对其起到保护性作用,并重建其呼吸功能。鱼藤酮模型中p38 MAPK信号通路被激活并促进神经元对线粒体的摄取。