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本实验室从西藏传统的乳制品Kefir粒当中分离获得一株具有高效降胆固醇能力的植物乳杆菌MA2,该菌株具有良好的发酵特性和益生功能,其胆固醇移除率最高可达45%,是一株在功能性食品领域有着广阔应用前景的菌株。 以植物孚乳杆菌MA2为研究对象,对其胆固醇移除率影响因素胆固醇添加浓度、菌体生长状态、菌体浓度与存活状态以及胆盐添加进行了探究。采用Mμ转座子随机插入的诱变方法,经过电转化将Mμ转座复合物诱导连入植物乳杆菌MA2基因组中,对其降胆固醇功能表型改变进行初步筛选研究。通过Mμ转座子插入的方法,筛选降胆固醇能力显著改变的突变株,若其插入位点是相关负调控基因,则其降胆固醇能力上升;若插入位点是直接调控降胆固醇的基因或者是相关正调控基因,则其降胆固醇能力下降。 通过构建含Mμ转座子的大肠杆菌重组质粒pUC18,经重组质粒提取、酶切、切胶回收、浓缩,使其浓度达到实验所需浓度标准,成功制备Mμ转座复合物。利用优化好的电转化条件,细胞生长至OD600nm≈0.5时制备感受态,恢复培养基蔗糖添加终浓度为0.1 mol/L,恢复培养时间为2h,在2 kV,25μF,电阻200Ω条件下,对其进行电转化,将Mμ转座复合物导入植物乳杆菌MA2基因组。经5μg/mL氯霉素抗性平板初步筛选获取突变株,提取突变株基因组提取,利用转座序列上氯霉素抗性基因设计特异性引物进行PCR扩增,验证突变株中Mμ转座子片段,构建突变子库,其结果显示在660bp处有明亮特异性条带,共获得166个突变子。 利用改良的邻苯二甲醛法对166个突变株进行胆固醇移除率测定,结果显示,与野生菌MA2相比,99号和163号突变子胆固醇移除率显著下降,分别为22.5%和32.3%,表明该突变子Mμ转座子插入位点基因为降胆固醇功能直接基因或者其相关正调控基因,相关基因被破坏,其降胆固醇能力相应下降。获得的其他突变子胆固醇移除率与野生菌MA2基本一致,表明其Mμ转座子插入位点基因与降胆固醇功能并不相关。以上研究结果为后续分离转座子插入的侧翼序列,从分子生物学角度研究菌体降胆固醇机制奠定了一定的基础。