念珠菌一般为条件致病菌，随着器官移植的普遍开展，恶性肿瘤、爱滋病和吸毒者的增多，以及人口的老龄化，导致免疫力低下人群不断增加，全身性真菌感染特别是念珠菌感染也日益增多，已成为各种疾病患者死亡增加的重要原因。随着检测水平的不断提高，真菌感染菌谱也在发生变迁。抗真菌药物的不合理应用，使耐药菌株不断增加，耐药机理日趋多样化。 念珠菌耐药的分子机制相当复杂，耐药株的产生，从分子生物学水平看，是耐药基因表达的结果。而以往的研究多以已知遗传位点的实验方法检测耐药基因，得到孤立的耐药基因，无法系统描绘念珠菌致病菌株的基因组图谱。由于念珠菌感染多为散发性，大样本研究相对难得。 念珠菌阴道炎是妇产科的常见病，大约75％的育龄妇女至少有一次发病，自从多种阴道局部用药和口服唑类抗真菌药物的问世以来，治疗念珠菌阴道炎已有较好的药物，但随着抗真菌药物的广泛应用，耐药现象的报道也在增多，部分病例反复发作，成为顽固性病例。虽然不至于象深部真菌感染那样危及生命，但明显影响生活质量，且发病率高，影响范围广。念珠菌阴道炎中，白念珠菌的检出率占80％以上，近年报道耐药菌增多，则以其它念珠菌，如近平滑念珠菌为多见。由于体外培养鉴定菌株与耐药检测的实验周期长，费用高，且现有的敏感菌株的鉴定以真菌的表型为基础，通过肉眼观察菌液的混浊度决定，因此，主观性较大，结果假阳性概率高，对临床用药指导意义有限。 随机扩增多态性DNA(Random Amplificated Polymorph DNA简称为RAPD)是在PCR技术基础上发展起来的一种新兴的基因分析法。PCR是1985年兴起的一项基因体 浙江大学硕土学位论文 外扩槽的分于生物学新技术，多年来在生命科学研究领域发挥了前所未有的作用。 1990年’if！。和’elsh等人建立了一种新的揭示基因组多态性的方法，即随机扩增 多态性 DNA（RAPD），并在徽生物的分型中广泛应用．RAPD的原理与常规 PCR基本相 同，在RAPD扩增法中，基因组DNA是在低严格条件下，用一种任意序列的寡核甘酸 引物使PCR扩增，这种低严谨的条件下允许引物退火达到基因组上的多处位点，产生 一系列的扩增洲A片段，在聚丙烯酞胺准胶电泳或琼脂糖凝胶上做多态性分析。由于 引物是随机合成的，不必预先知道待测基因组的碱基序列，从原理上讲通过增加随机 引物的数量可以对任何复杂的生物变异进行分型。其结果通过电泳条带的比较分析， 可以揭示基因组间的差异。本研究以念珠菌基因组为楔人点，通过RAPD法，探讨表 型耐药诛与敏感株之间的DNA基因组区别。通过RAP－PCR探讨耐药菌株与敏感菌株之 间的RNA基因组分型．研究中选用临床诊断为念珠茵阴道炎的病例，取阴道分泌物做 真菌学培养，按照法国梅里埃ATB F［JNG［J药敏实验板做药敏筛选。选择典型的敏感 菌株和耐药株为研究标本，实验中以近平滑念珠菌质控株ATCC22019为参考标推。 结果 一 菌群表型鉴定结果 共检测300株临床分高菌株，经法国梅里埃真菌鉴定系 统分析，共检测出六种真菌，它们分别是白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热 带念珠菌、酿酒酵母和克柔氏念珠菌。ATB F［JNGUS药敏实验共检测 300株分离真菌 对 6种抗真菌药物：5－氟胞啼陡（Flucytosin）、益康哇（Econazole）、酮康哇 （Ketoconazole）、米康哩（Miconazole）、两性霉素B（AmphotericinB）、制霉菌素’m 缸itu）的最低抑菌浓度＊IC人在 300株临床分离株中，最终挑选 154例典 型的敏感与耐药念珠菌进人实验。 二RAP卜盯R 引物的选择 在初步实验中，对 4条随机引物进行筛选，发现其中引物 ERIC 和ERIC皿在RAPI：yPCR反应中能清晰地显示念珠菌种同之间的多态性．用ERIC引物 对 154例典型的敏感茵株和耐药茵株进行 RAPInPCR扩增后获得稳定的基因组指纹图 一2 一 浙江大学硕士学位论立 谱。条带数在 4－7条之间。最大的片段＞700hP，最小的片段＜100hP。 六个菌种在RAPD扩增和电泳条件相同的情况下，出现图谱条带位置和数目不同 的扩增效果．种瞩之间有明显的区别． 耐药株和敏感株比较 对6种抗真菌药均敏感株与对卜氟胞啮陡耐药?