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目的:苯并(a)芘(benzo(a)pyrene,Ba P)是多环芳烃类化合物(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)的一种,其致畸、致癌、致突变性已经得到了学术界的公认,而近些年的文献报道显示Ba P还存在着生殖毒性。根据前人的研究,我们推测Ba P对人滋养细胞存在着生殖毒性。为此,我们以人早孕胎盘绒毛膜外滋养细胞(human trophoblast HTR-8/SVneo,HTR)为载体,观察Ba P是否对其有损伤作用。五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)是中药五味子的主要活性成份,由五味子制成的五子衍宗丸常用于提高人类的生育力。研究证实,Sch B可以激活核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2),并与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合形成Nrf2-ARE信号通路,从而发挥广泛的抗氧化应激、抗炎、抗凋亡及保护细胞免受损害的作用。有研究证实Nrf2-ARE通路的激活不仅可以加速Ba P在体内的代谢,还可以减轻Ba P对机体造成的氧化应激损伤。然而,目前并无关于Sch B可以在HTR细胞内对抗Ba P毒性的报道。因此,本研究旨在探讨Sch B是否可以通过激活Nrf2-ARE信号通路来抑制Ba P对HTR细胞造成的损伤作用,从而为将Sch B开发为环境污染物所致生殖毒性的保护剂提供理论支持。方法:1采用MTS细胞增殖实验探讨Ba P、Sch B单独/联合给药对HTR细胞增殖的影响。2采用基因干扰技术对Nrf2基因进行干扰并探讨干扰后Sch B、Ba P给药对HTR细胞增殖的影响变化。3采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测Nrf2、HO1、NQO1、SOD、KEAP1的m RNA在Nrf2基因干扰前后的表达。4采用western blot检测Nrf2、HO1、NQO1蛋白在Nrf2基因干扰前后的表达。5采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immnosorbent assay,ELISA)检测细胞培养基上清液中HO1和NQO1蛋白在Nrf2基因干扰前后的表达。6采用SOD试剂盒检测细胞培养基上清液中总SOD(total superoxide dismutase,T-SOD)活性在Nrf2基因干扰前后的表达。结果:1 MTS细胞增殖实验表明,与正常对照组相比,浓度为1、2.5、5、10、20、40μM的Ba P均对HTR细胞的增殖产生抑制作用(P<0.01)。浓度为0.25、0.5、1、2、5μM的Sch B均未抑制HTR细胞的增殖,其中浓度为0.5、1、2μM的Sch B对HTR细胞有轻微的促增殖作用(P<0.05),但是当浓度达到10μM时,Sch B对HTR细胞增殖产生抑制作用(P<0.01)。与Ba P组比较,浓度为0.25、0.5、1、2、5μM的Sch B可以减轻Ba P对HTR细胞造成的损伤(P<0.01)。2 Real-time PCR和western blot表明,1μg Nrf2 Si RNA转染HTR细胞后可有效干扰约75%的Nrf2 m RNA表达。并且在Nrf2基因干扰后,与Ba P组相比,浓度为0.5、1、2μM的Sch B对HTR细胞保护率分别由Nrf2基因干扰前的10.4%、19.1%、24.0%下降到4.5%、9.8%、15.6%(P<0.01)。3 Real-time PCR表明,在Nrf2基因干扰前Ba P组、0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组的Nrf2 m RNA表达分别是正常对照组的1.45、2.05、3.48、4.83倍(Ba P组P<0.05,0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组P<0.01),而在Nrf2基因干扰后分别下降为正常对照组的1.27、1.67、2.05、2.96倍(Ba P组P<0.05,0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组P<0.01)。上述各组HO1 m RNA表达由Nrf2基因干扰前分别是正常对照组的1.62、2.27、3.30、4.20倍(P<0.01)下降为Nrf2基因干扰后是正常对照组的1.39、1.77、2.29、2.67倍(Ba P组P<0.05,0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组P<0.01)。各组NQO1 m RNA表达由Nrf2基因干扰前分别是正常对照组的1.41、2.49、3.80、5.20倍(Ba P组P<0.05,0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组P<0.01)下降为Nrf2基因干扰后是正常对照组的1.30、1.79、2.82、3.59倍(Ba P组P<0.05,0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组P<0.01)。各组SOD m RNA表达由Nrf2基因干扰前分别是正常对照组的1.63、2.84、4.66、6.40倍下降为Nrf2基因干扰后是正常对照组的1.43、2.10、3.04、3.98倍(P<0.01)。另外,Nrf2基因干扰前后,与正常对照组相比,Ba P组均有效降低了KEAP1 m RNA的表达(P<0.01),0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4 Western blot分析表明,在Nrf2基因干扰前,Ba P组、0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组的Nrf2核蛋白表达分别是正常对照组的1.55、1.84、2.61、3.51倍(P<0.01),而Nrf2基因干扰后分别是正常对照组的1.32、1.56、2.05、2.66倍(Ba P组P<0.05,0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组P<0.01)。Nrf2总蛋白表达由Nrf2基因干扰前分别是正常对照组的1.36、1.69、1.93、2.33倍(P<0.01)下降为Nrf2基因干扰后分别是正常对照组的1.18、1.43、1.54、1.76倍(Ba P组P<0.05,0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组P<0.01)。HO1总蛋白表达由Nrf2基因干扰前分别是正常对照组的1.15、1.42、1.86、2.28倍(P<0.01)下降为Nrf2基因干扰后是正常对照组的1.09、1.23、1.50、1.72倍(Ba P组P<0.05,0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组P<0.01)。NQO1总蛋白表达由Nrf2基因干扰前分别是正常对照组的1.14、1.42、1.77、2.23倍(P<0.01)下降为Nrf2基因干扰后是正常对照组的1.08、1.23、1.52、1.80倍(Ba P组P<0.05,0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组P<0.01)。5 ELISA实验结果表明,在Nrf2基因干扰前,Ba P组、0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组的细胞上清液中HO1蛋白表达分别是正常对照组的1.08、1.16、1.27、1.40倍(Ba P组P<0.05,0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组P<0.01),而在Nrf2基因干扰之后各组分别下降为正常对照组的1.05、1.09、1.16、1.25倍(Ba P组P>0.05,0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组P<0.01)。细胞上清液中NQO1蛋白表达由Nrf2基因干扰前分别是正常对照组的1.13、1.37、1.56、1.67倍(P<0.01)下降为Nrf2基因干扰后分别是正常对照组的1.07、1.15、1.26、1.35倍(P<0.01)。6 SOD活性分析表明,在Nrf2基因干扰前,Ba P组、0.5、1、2μM Sch B与Ba P联合用药组的细胞上清液中T-SOD活性分别是正常对照组的1.08、1.23、1.36、1.48倍(P<0.01),而在Nrf2基因干扰后下降为分别是正常对照组的1.05、1.16、1.24、1.33倍(Ba P组P<0.05,0.5、1、2μM Sch B联合Ba P用药组P<0.01)。结论:1 Ba P对HTR细胞有直接损伤作用。2一定浓度的Sch B(≤5μM)对HTR细胞无损伤作用并可以降低Ba P对HTR细胞的损伤程度。3 Sch B可以通过激活Nrf2-ARE信号通路来抑制Ba P对HTR细胞的损伤。