论文部分内容阅读
人工诱导雌核发育(Artificially induced gynogenesis)是指通过物理、化学或生物学方法激活卵子,启动其卵裂机制,卵子仅依靠雌核发育形成胚胎,进而产生只具有母系遗传物质的后代个体的发育形式。雌核发育后代的遗传物质完全来源于雌性亲本,便于进行基因纯化和纯系克隆,因此人工诱导雌核发育技术在水产生物遗传改良和新品种培育方面具有潜在的应用价值。同时,雌核发育可以为单倍体研究、性别决定机制、基因作图、基因-着丝粒重组等问题的研究提供实验材料,在基础遗传学研究的相关领域中具有重要意义。本研究以我国北方沿海养殖贝类栉孔扇贝(Chlamys farreri)为研究对象,进行了紫外线照射灭活栉孔扇贝精子遗传物质中实验参数的优化,对紫外灭活精子诱导的栉孔扇贝雌核发育后代进行单个胚胎全基因组扩增(Whole GenomeAmplification,WGA),并利用已开发的栉孔扇贝单核苷酸多态性(Single Nucleaotide Polymorphism, SNP)标记对扩增产物进行评价与分析。所获得主要结果如下:1、使用不同辐射剂量的紫外线照射栉孔扇贝精子,使其达到遗传失活的状态,使用遗传失活的精子对栉孔扇贝正常卵子进行授精,诱导雌核发育获得后代胚胎。结果表明,辐射强度为800μW·cm-2·s-1的紫外线下照射50s是栉孔扇贝精子遗传失活的适宜辐射剂量,此条件下流式细胞仪检测胚胎细胞单倍体率为82.5%。在照射时间增加过程中,早期胚胎存活率在20s之前呈下降趋势,20s后转而上升,至40s时达到最大值77.5%,体现出较明显的“Hertwig效应”。2、细胞荧光染色观察结果显示,雌核发育后代胚胎的细胞数量满足全基因组扩增反应对细胞数目要求,采用逐级稀释的方法,在显微镜下挑选分拣出单个胚胎,并利用多重置换扩增的方进行单胚胎全基因组扩增。经检测,扩增产物主带的片段长度较长,产物DNA总量在25μg左右。SNP标记的分型实验对扩增产物的评价结果表明,雌核发育后代胚胎全基因组扩增产物的分型检出率为96.27%,SNP分型结果与标准对照组分型结果的一致性比率为99.03%。3、实验使用96个SNP位点对雌核发育胚胎的基因组扩增产物的纯合性进行检测分析,在所检测的胚胎中,基因位点纯合率介于91.67%~96.88%之间,平均为(94.81±1.56)%,显著高于相应雌性亲本的位点纯合度(t检验,P<0.05)。对32个位点上雌核发育家系GF5中雌性亲本等位基因在后代中分离情况的统计结果表明,24个位点符合孟德尔分离规律1:1的预测值,8个位点偏离1:1的理论分离值(χ2检验,P<0.05)。