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糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常见的微血管并发症,是成年人最主要的致盲疾病之一。中医药在改善视力,延缓DR的发生、发展,促使发生病理变化的眼底改善以及改善患者全身整体状况,提高患者生活质量方面有其独特的优势,显示出治疗DR的广阔前景。本课题组前期大量临床及药理研究表明,由地黄、丹参、葛根、人参组成的补肾活血方具有显著防治DR作用。课题组前期对该方防治DR药效物质基础及作用机制开展了部分研究,但对其体内外化学成分的系统描述及作用机制的深入研究尚显不足。为此,本文基于UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术对补肾活血方体内外化学成分进行系统分析,从大鼠组织细胞水平及代谢组学角度对其作用机制开展了初步研究:1.补肾活血方体内外化学成分分析1)对补肾活血方体外化学成分进行研究,建立化学组分库。利用UPLC-Q-Exactive高分辨质谱仪联用技术,采用正、负离子监测模式、全扫描及自动触发二级质谱扫描功能,对补肾活血方化学成分进行快速识别及鉴定。通过质谱数据、对照品比对,共鉴定出86个(其中正离子模式下10个)化合物,主要化学成分包括异黄酮类、酚酸类、人参皂苷类及少量的环烯醚萜类化合物。2)对补肾活血方入血移行成分进行初步研究。通过前期建立的UPLC-Q-Exactive分析方法及主要化学成分鉴定结果,对比补肾活血方、空白血清及给药血清图谱,对各个峰进行鉴别分析,确定28个(其中正离子模式下2个)化合物为补肾活血方入血原型成分。2.补肾活血方治疗DR作用机制初步研究1)从大鼠组织细胞水平开展其作用机制研究:采用高脂饲料诱导联合注射低剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制备大鼠糖尿病视网膜病变模型,运用免疫组化染色结合图像分析测定大鼠视网膜中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor,HIF-1α)蛋白的表达。结果显示,与空白组相比,模型组大鼠视网膜中积累了大量的VEGF、HIF-1α蛋白,其光密度急剧增加,且具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,给药组大鼠视网膜中两者的积累量显著减少(P<0.05),表明补肾活血方对DR具有一定的治疗作用,通过直接抑制VEGF高表达或/和通过抑制HIF-1α的高表达而抑制VEGF mRNA转录,进而降低VEGF蛋白的高表达可能是其治疗DR的重要作用机制之一。2)基于代谢组学开展其作用机制研究:收集造模和补肾活血方治疗过程中大鼠尿液,运用UPLC-Q-Exactive分析方法,建立大鼠尿液代谢指纹图谱,结合多种分析方法,对尿液中所有代谢产物进行研究,找到与DR模型有关的9个潜在生物标志物,分别为苯乙酰甘氨酸、3-甲基二氧吲哚、马尿酸、硫酸对甲酚、对甲酚硫酸葡萄糖苷酸、苯乳酸、胆酸、5-L-谷氨酰-牛磺酸及一个未知成分。经补肾活血方治疗后,除苯乳酸和未知成分含量水平未被改善,其余成分含量水平均有所回调。对其进行深入研究发现,补肾活血方通过改善潜在生物标志物参与的肠道菌群代谢、脂质代谢、色氨酸代谢等通路紊乱可能是治疗DR的重要作用机制之一。上述研究结果为补肾活血方体内过程分析和药效物质研究奠定了基础,为深入探讨补肾活血方防治DR的作用机制提供实验依据,亦为中药复方的系统研究提供了新的思路。