3-羟基丁酮是我国传统固态发酵食醋中继乙酸和糠醛之外的第三高含量挥发性物质,3-羟基丁酮还是食醋标志性功能保健成分——川芎嗪的前体,川芎嗪是中药川芎中一种重要的药用活性生物碱。巴氏醋杆菌是一种食醋酿造典型微生物,可产生3-羟基丁酮。分析发现该菌细胞中的als操纵子上存在两种alsS基因,预示该菌中可能存在一种新颖的3-羟基丁酮合成途径。实验室从中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购得一株Acetobacter pasteurianus CICC 22518。本论文对于该菌中乙酰乳酸合成酶基因alsS的功能进行分析研究。首先,对两种乙酰乳酸合成酶基因分别进行异源表达。对纯化后的乙酰乳酸合成酶蛋白进行酶学性质分析。结果显示,表达菌株Escherichia coli BL21(pET28a-alsS1)可高表达具有活性的乙酰乳酸合成酶,在37℃添加0.6 mM IPTG的LB培养基中诱导7 h,乙酰乳酸合成酶的比酶活可达129.5 U/mg;重组表达的乙酰乳酸合成酶AlsS1最适温度为55℃,最适pH为6.5。Na~+、K~+对AlsS1酶活无显著性影响,EDTA对其酶活有强烈的抑制作用。添加辅酶NADP、NADPH、NAD、NADH及支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸对AlsS1的酶活无显著性影响。AlsS2在进行温度和pH梯度摸索后未检测到酶活。其次,在A.pasteurianus中对两种乙酰乳酸合成酶基因进行敲除,构建3株基因敲除菌株,分别命名为A.pasteurianus-△alsS1、A.pasteurianus-△alsS2、A.pasteurianus-△(alsS1+alsS2),并对其生长情况、3-羟基丁酮生成情况、L-乳酸降解情况进行了研究。研究发现敲除菌株的生物量均低于野生菌株,说明基因的敲除会在一定程度上影响菌体自身的生长。乙酰乳酸合成酶基因alsS1被敲除后,3-羟基丁酮的合成受到显著影响,说明此基因对3-羟基丁酮的合成起主要作用,而alsS2基因也起到一定的作用,但并非主要作用。菌株A.pasteurianus-△(alsS1+alsS2)在发酵过程中未检测到3-羟基丁酮的生成,说明基因alsS1和alsS2同时被敲除后,阻断了3-羟基丁酮的形成通路。野生菌株在发酵中对于L-乳酸的利用速率最高,敲除菌株对于L-乳酸的利用速率均低于野生菌株。此研究为后续提高发酵菌株的3-羟基丁酮产量奠定理论基础。