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研究背景:非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD）已经成为一个全球性的健康问题,其与肥胖及2型糖尿病（Type 2 diabetes,T2D）等疾病密切相关。除肝脏本身病变外,其肝外并发症也严重威胁患者健康,尤其是心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）,而NAFLD所导致的肝脏脂质代谢改变也推动了动脉粥样硬化性血脂异常的发生发展,进一步加剧这些患者的CVD风险。随人们生活方式的改变,NAFLD发病率正逐年攀升,但是其发病机制尚不完全明确,且缺乏有效的防治手段。NAFLD的发病机制与脂毒性、线粒体功能障碍、内质网应激、炎性细胞因子、脂肪组织功能障碍和肠源性内毒素等多重打击因素相关,最终出现脂肪变性、脂毒性和炎症的恶性循环,导致肝脏的组织病理学和生化特征发生错综复杂的变化。目前对NAFLD治疗主要是对生活方式及饮食的干预,暂无FDA批准用于治疗NAFLD的药物上市。瞬时受体电位通道A1亚型（Transient receptor potential ankyrin 1,TRPA1）是一种非选择性阳离子通道,该通道激活后主要介导细胞外阳离子如NA+、H+内流,尤其是引起Ca+内流增加。与能量代谢、食欲调节、氧化应激、疼痛、炎症、瘙痒和组织损伤及修复相关。TRPA1激动剂在减轻体重、分泌饥饿和饱腹感激素、分泌胰岛素和产热方面也表现出一定的作用,这提示TRPA1通道具有作为靶点来解决肥胖和及相关合并症的潜力。桂皮醛（Cinnamaldehyde,CA）是一种经典的TRPA1激动剂,具有抑制中枢、抑制胃动力、诱导肾上腺儿茶酚胺分泌作用和降糖作用。他人研究发现CA可减少肥胖动物模型中的内脏脂肪沉积、调节肝脏脂质代谢、自噬和内质网应激[1],认为CA改善内脏脂肪沉积部分作用是可能是通过促进交感神经末梢释放去甲肾上腺素,使棕色脂肪产热增加,促进能量代谢、减轻内脏脂肪[2]。既往研究表明TRPA1激动剂可改善肥胖小鼠的内脏脂肪沉积,但TRPA1在NAFLD中的作用尚无文献阐述,因此我们将通过高脂干预C57BL6/J小鼠构建NAFLD动物模型,利用棕榈酸钠（sodium palmitate,PA）干预人肝癌细胞（He PG2）构建细胞模型,结合组织形态、功能及分子生物学的方法观察TRPA1在NAFLD中的作用,初步探索TRPA1在NAFLD中的作用,以期为NAFLD防治提供新思路。研究目的:1、利用C57BL6/J雄性小鼠,高脂喂养构建NAFLD动物模型,观察TRPA1在NAFLD中的表达变化,同时予以TRPA1激动剂CA灌胃干预,观察小鼠肝脏功能及形态改变,以探索TRPA1在NAFLD中的作用。2、利用He PG2细胞,予以PA干预构建NAFLD细胞模型,观察TRPA1在NAFLD中表达及功能的改变,同时结合TRPA1激动剂CA及其拮抗剂HC030031干预,通过观察细胞内脂滴面积及含量的变化,初步探索TRPA1在NAFLD中的作用。材料与方法:1、动物实验将18只雄性C57BL6/J小鼠随机分为普通饮食组（Normal control chow diet group,NCD）、高脂饮食组（High fat diet,HFD）、高脂饮食+桂皮醛组（HFD+CA）,每组各6只,喂养22周,实验结束后收集小鼠血液及肝脏标本,油红O染色及苏木素-伊红染色（H＆E）观察小鼠肝脏组织形态变化,生化法检测小鼠肝脏及血浆中脂质含量。免疫组织化学染色、Western blot、RT-PCR检测TRPA1在肝脏中的表达变化情况。2、细胞实验采用免疫荧光染色检测TRPA1在小鼠正常肝脏细胞上的表达情况,利用PA干预He PG2细胞构建NAFLD模型,为寻找适宜的造模浓度,通过CCK-8检测细胞活力、流式凋亡实验检测细胞凋亡并结合油红O染色观察细胞内脂滴聚集情况,选取细胞活性较好且能诱导脂质沉积的PA浓度用于后续的实验,将He PG2细胞分为对照组（Ctrl）、棕榈酸钠组（PA）、棕榈酸钠+桂皮醛组（PA+CA）、棕榈酸钠+桂皮醛+HC030031组（PA+CA+HC）、棕榈酸钠+HC030031组（PA+HC）,利用Western blot、RT-PCR检测TRPA1在He PG2细胞中的表达情况,油红O染色及生化法观察细胞内脂质沉积情况。结果:1、构建非酒精性脂肪性肝病动物及细胞模型在动物试验中,采用高脂饮食喂养小鼠构建非酒精性脂肪性肝病动物模型,与NCD相比较,HFD小鼠肝脏油红O染色阳性脂滴含量明显增加,表明肝脏出现脂肪变性,提示成功体内NAFLD模型构建。在细胞实验中,予以不同浓度的PA干预He PG2细胞48h后,发现与Ctrl组相比,PA组（浓度分别0.1 m M、0.2 m M、0.4 m M、0.5 m M）He PG2细胞活力分别为（82.67±3.58）%、（73.53±3.02）%、（65.13±3.53）%、（54.57±2.92）%（P＜0.0001,n=6）;凋亡比例分别为（8.37±1.09）%、（10.97±1.20）%、（28.10±1.44）%、（49.17±1.41）%（P＜0.05,n=6）;细胞内脂滴面积分别为（8.45±0.66）%、（13±0.54）%、（17.7±0.70）%、（20.1±0.60）%（P＜0.05,n=6）。当PA浓度为0.4 m M时,细胞活力在60%左右、凋亡比例在28%左右,且能较好的诱导细胞内脂滴形成（细胞内脂滴面积为17.7±0.70%）,故选择浓度为0.4 m M PA干预48h构建NAFLD细胞模型。2、TRPA1在NAFLD中的表达及功能下调免疫荧光染色提示TRPA1在正常小鼠肝脏细胞中有表达;Western blot、RT-PCR结果提示NAFLD动物及细胞模型中TRPA1 m RNA及蛋白表达水平均显著下降（P＜0.05）,且细胞实验中还发现NAFLD细胞模型中钙离子内流明显减少,这提示TRPA1功能下调。结果表明TRPA1在NAFLD中的表达及功能均下调。3、激动TRPA1改善小鼠肝脏脂质沉积动物实验中,高脂喂养后,与NCD组小鼠相比,HFD组小鼠血浆及肝脏TC、TG含量显著增加（P＜0.001）,而予以CA干预后的HFD+CA组较HFD组中小鼠的血浆及肝脏TC、TG含量均下降（P＜0.05）,结果提示激动TRPA1可降低高脂饮食诱导的小鼠血浆及肝脏脂质含量升高。4、激动TRPA1改善He PG2细胞内脂滴聚集细胞实验中,与Ctrl组相比,各组细胞内脂滴面积分别为PA组（18.1±0.72）%、CA+PA组（12.2±0.56）%、CA+HC+PA组（17.3±0.84）%、HC+PA组（21.33±0.77）%（P＜0.05）,与Ctrl组相比,PA组出现明显的细胞内脂滴面积增加,CA激动TRPA1后细胞内脂滴聚集明显减少,而这种作用被HC030031部分拮抗,表明激动TRPA1可减轻NAFLD的脂质沉积。结论:1、高脂饮食干预能够构建NAFLD动物模型,浓度为0.4 m M的PA干预He PG2细胞48h能够构建NAFLD细胞模型。2、NAFLD动物及细胞模型中TRPA1蛋白及m RNA表达水平均下降,且TRPA1功能也下调。3、激动TRPA1后NAFLD动物及细胞模型均表现出脂滴减少及TC、TG的水平降低,提示通过激动TRPA1可改善NAFLD中的肝脏脂质沉积。