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作为最重要且常见的蛋白质翻译后修饰过程之一,糖基化参与到生物体的各种生理和病理过程。由于存在不同异头碳分支和连键形式,糖链的结构多样性远远超过线性的核酸和蛋白质;而且蛋白质的糖基化为非模板驱动的动态合成方式,导致了聚糖结构的多样性和微观不均一性。正因为聚糖具有上述特点,增加了其分析的难度和复杂性。基质辅助的激光解吸电离质谱(MALDI-MS)是N-连接聚糖结构鉴定的重要技术平台之一,其具有操作简单,谱图易读,耐杂质干扰等优点。然而,由于N-聚糖自身的亲水性及缺乏碱性基团导致其电离化效率低,并且含唾液酸聚糖在质谱检测过程中容易发生源内和源后裂解,进而影响质谱对聚糖的准确和完整的鉴定。本文利用MALDI-MS为分析工具,开发了非特异性酶切结合共衍生、快速酶切结合共衍生等方法用于N-聚糖的高灵敏度分析的方法,然后将其成功应用于痕量的标准糖蛋白、血清及细胞来源的样品分析,这为后续的有限来源的生物样品分析和疾病相关生物标志物的发现提供了可能。主要研究内容如下:(1)建立了一种非特异性酶切结合共衍生用于N-聚糖高灵敏度检测的方法。该方法通过使用pronase E穷尽式酶切标准糖蛋白,得到仅含一个天冬氨酸的糖氨酸(glycan-Asn),然后利用TMPP-Ac-OSu与因天冬氨酸的存在而引入的-NH2活性基团反应,进而引入了一个永久正电荷,提高了 MALDI-MS检测的灵敏度。同时,甲胺化也被用于中和天冬氨酸及含唾液酸多糖中的羧基,进一步提高了检测的灵敏度。糖氨酸在仅TMPP-Ac衍生的情况下,有超过10倍的灵敏度提高,中性糖氨酸在共衍生之后有超过20倍的灵敏度提高,而酸性糖氨酸有超过50倍的灵敏度提高。此外,该方法成功应用于核糖核酸酶B,卵清蛋白和转铁蛋白三种糖蛋白的糖谱分析。(2)建立了一种快速酶切结合共衍生用于N-聚糖高灵敏度检测的方法。该方法包括通过使用酶友好型的表面活性剂结合常规的变性剂来实现快速去糖基化,并且在碱性条件下得到葡糖胺形式的N-聚糖。然后用TMPP-Ac-OSu对葡糖胺进行原位衍生。对于含有唾液酸的糖蛋白,进一步使用甲胺化中和掉唾液酸中的羧基。该方法使整个聚糖分析过程从几天缩短到几个小时。利用该方法,仅用25nL人血清就检测到超过50个N-聚糖,显示了该方法在微量样品N-连接聚糖分析方面的优势。(3)对快速酶切共衍生方法进行优化,实现了微量细胞样品的N-聚糖分析并将其将其用于聚糖生物标志物的初步研究。使用细胞为材料进行聚糖分析时,常会受限于细胞样品的来源、数量及前期复杂且耗时的样品处理过程。通过对(2)中的方法使用的基质进行优化:发现与DHB相比,以CHCA作为MALDI-MS检测时的基质可以得到更均匀的结晶,更强的信号强度和更高的分辨率。此外,对文献中常用的细胞蛋白抽提方法进行了比较,发现以甲醇/氯仿/水为抽提液,可以得到较好的蛋白回收率。以HeLa细胞为例用于优化后的方法验证,发现使用约105个细胞即检测到大部分高丰度的糖型。此外,利用上述优化后的方法对三种异质性的肝细胞(L-02、HepG2和Bel-7402)进行了细胞膜蛋白和细胞分泌蛋白的全面分析,发现随着肿瘤细胞转移能力的增加,细胞膜蛋白和分泌蛋白中唾液酸化聚糖都有明显增加。综上所述,本文提出了一种非特异性酶切结合TMPP-Ac-OSu/甲胺化共衍生方法用于微量标准糖蛋白样品的分析,实现了 N-聚糖的高灵敏度检测;建立了一种快速酶切结合共衍生方法实现了不同来源(标准糖蛋白、人血清、细胞)的微量乃至痕量样品的N-聚糖分析,这为科研及临床来源的微量样品的N-聚糖分析打下了基础。