塞内卡病毒(Seneca Valley virus,SVV),在遗传上与小RNA病毒科、心病毒属病毒关系相近,临床上能引起猪的鼻吻、蹄冠状带部位出现水疱样病变,偶见腹泻症状,病情急促,新生仔猪病死率高,我国现已出现多省份猪场感染SVV的病例,猪群感染SVV后表现的临床症状与口蹄疫、猪水疱病、水泡性口炎、猪水泡疹等病毒感染后症状非常相似,在临床症状上常常引起混淆。如果未能对以上几种疫病及时作出准确的鉴别诊断,将导致防控措施采取不当,养殖成本大大提高。在我国,2016年首次分离到了SVV。国内外对SVV感染的实验室检测已经开发了电子显微镜、免疫组化、RT-PCR等检测方法。数字PCR(dPCR)技术作为建立在qPCR检测方法的基础上的核酸绝对定量的新技术,与此前发展起来的qPCR核酸相对定量方法比较,其定量方法更加灵敏和准确度更高,而且不需要建立标准曲线可直接判断结果。核酸标准物质是验证SVV检测方法、检测试剂是否科学、可靠的关键,也是实验室质量控制的重要手段,因此核酸标准物质的研制可为精准化疫病防控提供技术保障。国内针对塞内卡病毒检测方法的标准物质十分匮乏,各级检测机构缺少核酸标准物质。本实验设计了塞内卡病毒特异性引物及探针,建立了灵敏性高、特异性好的荧光定量PCR方法;进而筛选了数字PCR仪及试剂,建立了塞内卡病毒数字PCR检测方法,对其敏感性、特异性、重复性等特性均进行了验证;采用本研究建立的塞内卡病毒数字PCR方法对分离鉴定的塞内卡病毒进行绝对定量,对其均匀性、稳定性、重复性等进行了测定,制备塞内卡病毒核酸标准物质,联合8个有资质的实验室对塞内卡病毒核酸标准物质进行特性值的确定。结果如下:1、塞内卡病毒和口蹄疫病毒二重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立设计了FMDV和SVV特异性引物和探针,建立了在同一反应体系中可鉴别FMDV和SVV的二重实时荧光RT-PCR检测方法。本方法能高效扩增目的基因;最低能检测到1.0×10~1拷贝/μL。建立的FMDV和SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法是一种简便、快速、特异性和敏感性较好的诊断方法,可用于FMDV和SVV的快速检测及鉴别诊断。2、SVV微滴式数字PCR方法的建立及应用本研究在SVV实时荧光定量PCR方法的基础上,通过数字PCR supermix的选择、引物探针浓度的优化、反转录时间比对实验、退火温度优化、升降温速度的优化、SVV ddPCR检测方法的动态范围及灵敏度测定、ddPCR结果和荧光定量PCR结果换算等一系列的试验测试,成功建立了SVV ddPCR绝对定量检测方法。本方法能高效扩增塞内卡病毒目的基因,而对其他病原核酸无扩增。敏感性好,最低能检测到3个拷贝/μL。重复性计算出的变异系数为2.39%,建立的SVV数字PCR绝对定量检测方法可进行低峰值的样品进行很好的检测,而且能够对核酸进行绝对量的精确定量,可作为标准物质制备所采用的定量方法。3、塞内卡病毒核酸标准物质的制备、定值与应用本方法对塞内卡病毒候选物的筛选与鉴定,并采用建立的塞内卡病毒ddPCR绝对定量检测方法对塞内卡病毒浓度检测,细胞病毒培养液的预定值、均匀性初检等一系列研究,制备了塞内卡病毒核酸标准物质,并进行了分装;对其进行物理性状检验、灭活检验、支原体检验及其他病毒检验;进行了均匀性评估分析及最小取样量确定;对其短期稳定性及长期稳定性进行了考察。SVV核酸标准物质呈无色透明液体;病毒灭活检验盲传三代后,各代次细胞均无细胞病变;qPCR未扩增出曲线,说明标准物质已经灭活;支原体检验,均为阴性;其他病毒检验除SVV有扩增片段外,其他均无扩增;组内与组间无统计学差异,样品是均匀的;本核酸标准物质的最小取样量为200μl。塞内卡病毒核酸标准物质在4℃环境可稳定9d,在25℃环境可稳定1d。需冷链运输,运输时间不能超过9d。本标准物质在-20℃环境下可稳定6个月,可复融3次。选择8个有资质的实验室对塞内卡病毒核酸标准物质采用ddPCR绝对定量方法进行联合定值,从8个实验室检测的数据计算出塞内卡病毒核酸标准物质的均值为1.6×10~4 copies/μl,标准值为1.7×10~4 copies/μl,扩展不确定度为0.3×10~4 copies/μl。