论文部分内容阅读
钽(Ta)作为一种亲生物金属因其良好的稳定性、高摩擦系数、抑菌作用等优势近年来在骨组织工程领域得以广泛应用。但致密的材料结构由于较高的弹性模量在植入后将产生明显的应力遮挡效应,最终导致植入物周围骨吸收、植入物松动甚至脱落。因此,对材料进行多孔结构设计可以有效避免上述缺陷从而达到与天然骨组织完美匹配的力学要求。研究表明,多孔支架的孔隙特性诸如孔径、孔隙率、拓扑结构、通孔率等是影响其生物学效应的重要因素。然而,目前对于理想孔径和孔隙率以及相关作用机制的探讨观点各异,尤其对于3D打印多孔钽支架的研究尚不充分。本课题通过3D打印技术精确控制材料的结构参数,在保证相同设计构型的基础上制备出4种不同孔径和孔隙率的多孔钽支架,同时通过体内外模型比较其对成骨作用和骨整合的影响。实验主要分为以下三个部分:第一部分:3D打印多孔钽支架的制备和表征通过计算机辅助设计(CAD)建立孔径为100-200μm、200-400μm、400-600μm、600-800μm的三维模型(平均孔隙率分别为25%、55%、75%、85%),采用选择性激光熔化(SLM)技术制备出相同设计构型的多孔钽支架。支架的形貌特征以及孔径通过扫描电镜(SEM)进行评估,结果表明所有支架均呈相互连通的多孔结构,正六面体构型,表面均匀且较光滑。实际孔径分别为173.2±39.4μm、376.9±68.3μm、534.3±64.6μm、726.9±63.6μm,通过重量法测得支架实际的平均孔隙率分别为23%、53%、69%、79%。采用激光共聚焦显微镜(LSCM)测量支架的表面粗糙度(RA)分别为21.9±3.4μm、17.2±3.1μm、31.0±5.7μm、25.4±5.2μm且各组间没有明显差异(P>0.05)。上述结果与设计模型的参数基本保持一致,说明3D打印SLM技术虽不能完全达到零误差的要求,但仍能较精确地控制材料的微孔结构及各项参数,是当前制备多孔生物支架的可靠手段。第二部分:不同孔径和孔隙率的多孔钽支架对mBMSCs生物学行为影响的体外实验研究实验组将4种不同孔径和孔隙率的多孔钽支架与小鼠骨髓基质细胞(mBMSCs)共培养,对照组则进行单纯细胞培养。通过细胞增殖实验发现各组支架均无细胞毒性,培养第7d时相对增值率分别为138.5%、153.9%、179.3%、167.9%,且400-600μm组吸光度值(OD)高于其它各组(P<0.05)。活死细胞染色(Live-Dead)提示各组支架几乎无死细胞附着,显示出良好的生物相容性。同时,在相同的三维空间内(X 1200μm、Y 1200μm、Z 200μm),400-600μm组相比其它各组表现出更明显的荧光强度分布。扫描电镜显示出各组支架的细胞粘附数量随时间增加的趋势,且逐渐覆盖材料表面和孔隙。细胞呈梭形,伪足伸展并相互连接跨越孔隙。鬼笔环肽/DAPI染色同样可见400-600μm组相比其它各组表现出更强的促进细胞粘附和增殖能力。茜素红染色分析可知400-600μm组和600-800μm组促成骨性能优于其它各组(P<0.05)但两组间结果无统计学差异(P>0.05)。诱导7d时成骨相关因子ALP和COL-I的表达也显现出相似的规律,而600-800μm组成血管因子VEDF和VWF的表达水平高于其它各组(P<0.05)。计算流体动力学(CFD)分析可知600-800μm组总体有效渗透率比其它3组高约5-25倍,但支架有效接触面积则呈减小的趋势。以上结果说明孔径和孔隙率过大或过小的SLM多孔钽支架均不利于促进mBMSCs细胞的粘附和增殖,上述生物学行为在有限的范围即400-600μm(孔隙率75%)可获得较为理想的结果。孔径范围400-600μm(孔隙率75%)和600-800μm(孔隙率85%)的支架在诱导mBMSCs细胞成骨分化过程中具有更明显的优势,且大孔径支架中细胞的成骨分化过程更倾向于通过上调成血管相关因子表达的方式进行。第三部分:不同孔径和孔隙率的多孔钽支架在兔股骨缺损模型中对新骨形成和骨整合影响的体内实验研究实验组将4种不同孔径和孔隙率的圆柱形多孔钽支架植入兔股骨髁骨缺损模型,对照组则为同样大小的单纯骨缺损模型。于植入后第2、4、8w分别进行X线透视、高能量CT扫描、组织切片染色及元素分析评价新骨长入和骨结合程度。CT扫描发现,400-600μm组在植入4w后显示出更高的骨体积分数(BVF)(P<0.05)且最终不低于空白对照组(P>0.05)。组织学分析可知,植入4w后400-600μm组骨长入面积率表现出与CT扫描结果相似的规律且200-400μm组和400-600μm组在术后8w的骨长入深度大于其它两组(P<0.05)。植入早期400-600μm组骨接触率高于其它各组(P<0.05),而植入4w后各组间骨接触率、界面结合强度以及孔隙内新骨成熟度未发现明显差异(P>0.05)。最后,利用纳米压痕技术测得的股骨髁周围骨组织弹性模量等参数结合有限元分析进一步验证了界面力学实验的真实性和有效性。以上结果充分说明400-600μm孔径(孔隙率75%)的SLM多孔钽支架能够获得更多的新骨长入并且更早形成理想的骨整合界面。总结以上结果我们认为,3D打印技术已成为制备多孔生物支架的可靠手段,且孔径和孔隙率是影响SLM多孔钽支架成骨作用和骨整合效应的重要因素,400-600μm孔径(孔隙率75%)的多孔钽支架可获得满意的骨长入且在早期形成更稳定的骨-植入物界面。本课题为未来多孔植入物修复骨缺损的研究和应用提供了可行的方向。