论文部分内容阅读
背景及目的:支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病,中性粒细胞是支气管哮喘气道炎症的主要效应细胞之一,中性粒细胞在支气管内聚集是严重类型哮喘的共同特征,但支气管内中性粒细胞增多的机制并不清楚。本研究主要从细胞水平去阐述KLF2是否通过调节CXCR1、CXCR2、L-selectin、CD11a、CD11b、CD18的表达来影响类中性粒细胞粘附迁移过程。研究方法:(1)培养HL-60细胞,DMSO诱导分化为类中性粒细胞,通过Diff染色观察细胞核形态及Realtime-PCR检测中性粒细胞分化标志物CD11b mRNA的表达,确定是否诱导成功(2)用空载及KLF2-RNAi慢病毒载体转染类中性粒细胞,随机分为空白组、空载组和siRNA干预组。应用荧光显微镜、Western blot法进行转染鉴定。(3)Realtime PCR检测三组中CXCR1、CXCR2、L-selectin、CD11a、CD11b、CD18mRNA的表达,Western blot检测三组中CXCR1、CXCR2、L-selectin的蛋白表达,流式细胞术检测CD11a、CD11b、CD18平均荧光强度。(4)荧光显微镜观察三组中标记有calcein-AM的类中性粒细胞对脐静脉内皮细胞粘附情况及应用Transwell实验计数浓度为10ng/ml的IL-8对三组类中性粒细胞的趋化迁移率。结果:1类中性粒细胞的鉴定CD11b为公认的中性粒细胞分化成熟标志之一,HL60细胞在经1.3%DMSO诱导后,通过Realtime-PCR检测其CD11b mRNA表达量并与未经过诱导的HL60细胞相比较,诱导后呈明显增多(P<0.01),Diff染色油镜下观察类中性粒细胞核呈现肾型及双叶。2KLF2的干扰荧光显微镜观察带有GFP的慢病毒荧光转染效果,计算感染效率达到90%以上;Westernblot检测KLF2蛋白表达,发现干扰组的表达与其他两组比较明显减少(P<0.01),而空白组与空载组比较差异无统计学意义,计算其敲除率约为76%。3mRNA及蛋白的检测(1)Realtime PCR结果显示:KLF2干扰组与空白组、空载组相比较,CXCR1、CXCR2、CD11a、CD11b、CD18mRNA的表达呈明显增多,而L-selectin mRNA的表达明显减少,差异均有统计学意义(P<0.01);而以上因子空白组与空载组相比较,差异均无统计学意义。(2) Western blot结果显示:KLF2干扰组与空白组、空载组相比较,CXCR1、CXCR2蛋白的表达明显增多,而L-selectin蛋白的表达明显减少,差异均有统计学意义(P<0.01);而以上因子空白组与空载组相比较,差异无统计学意义。(3)流式细胞术检测结果显示干扰组CD11a、CD11b、CD18的平均荧光强度与空白组,空载组相比较明显增多(P<0.01);而空白组与空载组相比较,差异无统计学意义。4类中性粒细胞的粘附及迁移实验(1)荧光显微镜观察结果显示:KLF2干扰组镜下的类中性粒细胞粘附数与空白组、空载组相比较呈明显增多(P<0.05);而空白组与空载组相比较,差别无统计学意义。(2)10ng/ml浓度的IL-8对类中性粒细胞迁移率,KLF2干扰组迁移率与空白组、空载组相比较呈明显增多(P<0.01),而空白组与空载组相比较,差异无统计学意义。结论:(1)KLF2可以通过调控粘附分子CD11a、CD11b、CD18的表达,影响类中性粒细胞的粘附能力,而KLF2对L-selectin的调控可能对类中性粒细胞的粘附能力影响不大。(2)KLF2可以通过调控CXCR1、CXCR2,增加IL-8趋化下类中性粒细胞趋化迁移能力