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癫痫是一种神经系统常见疾病,近年来虽然在癫痫的诊断与药物处理方面取得了很大进展,但在癫痫的治疗上仍有诸多不尽人意之处.迄今为止,大多数传统抗癫痫药物(AED)是化学药物,副作用大且不能有效控制.克服传统AED的缺点,为难治性癫痫病人提高疗效,研究开发具有预想特征的新一代AED很有意义。
癫痫的特征为反复发作的、大脑神经细胞异常放电所致的大脑功能失调。正常生理条件下,神经元处于精细调控之中。正,负调控因子的相互作用,使得神经网络存在着微妙的兴奋一抑制平衡.正调控因子有助于神经元的生长和再生,而一些负调控因子则可使神经元避免因代谢过度旺盛而导致的代偿性损伤。近年来,多个脑源性的神经抑制因子得到确认。从这些抑制因子入手,开发新的抗癫痫药物,以抑制因子来矫正失衡的神经网络,就给治疗癫痫带来了新思路。
本实验以猪脑为原料,经过了超滤,Sephadex G-10凝胶过滤层析和C18反相高效液相色谱等多种分离,纯化方法,分离出了一种具有抗癫痫活性的小分子类神经肽抑制因子(Neuropeptide-like inhibitor,NPI)。并对其活性及性质进行了初步探讨。
通过噻唑蓝比色法(MTT比色法)分析每步纯化的NPI样品对噬铬细胞瘤株PC12细胞生长的影响。结果显示超滤后的NPI初提原样及多次纯化后的活性组分都对PC12细胞显示出抑制作用,且该抑制作用呈量效关系。NIP初提原样在125.00μg／ml具有抑制活性,而经过Sephadex G-10凝胶过滤层析初次纯化后的活性组分NPI-1在6.250μg／ml,NPI-4在3.125μg／ml时即显示出抑制活性.经过C18反相层析的进一步纯化后,活性组分NPI-4-1在很低的浓度0.781μg／ml时就表现了抑制活性。与对照组苯妥英钠(phenytoin sodium,PHT-Na)12.500μg／ml时产生抑制作用相比,抑制效果很显著。相同浓度下,NPI-4—1也表现了更高的抑制率。
建立戊四氮(PTZ)致小鼠急性癫痫动物模型,利用NPI样品加以干扰,观察癫痫小鼠行为学。与对照组比较,给予NPI后,小鼠初次惊厥时间明显延长(P<0.01),惊厥程度及死亡率明显下降(P<0.05),并且也表现了很好的量效关系.
通过凝胶高效液相色谱分析得到了初次纯化后的两个NPI样品活性组分相对分子量分别为4411和1612。通过C18反相层析分析了最终纯化NPI样品的氨基酸组成,结果显示其至少含有Ser、Gly、Ala、Tyr、Val、Phe、Lys等7种氨基酸。
本实验结果表明NPI不仅具有体外抑制神经细胞的作用,而且对化学药品(PTZ)诱导的急性癫痫也有抗惊厥作用。与阳性药物苯妥英钠对照相比,在剂量和效果上,NPI都更有优越性.