【摘 要】
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目的:脂质或脂质中间体在非脂肪组织（如肝脏和肾脏）中的过度积累导致细胞功能障碍和死亡,这一病理生理过程称为脂毒性。它通常会发生在糖尿病、肥胖和其他代谢紊乱患者中。心脏也可以受脂肪毒性的影响,主要表现为心肌纤维化,心室重构甚至可能会导致心力衰竭,主要原因可能是过量饱和脂肪酸（SFA）在心肌细胞中沉积。大量研究表明SFA可以在体外和在体内直接导致心肌脂毒性损伤,其机制主要包括炎症、内质网应激、自噬改变
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目的:脂质或脂质中间体在非脂肪组织（如肝脏和肾脏）中的过度积累导致细胞功能障碍和死亡,这一病理生理过程称为脂毒性。它通常会发生在糖尿病、肥胖和其他代谢紊乱患者中。心脏也可以受脂肪毒性的影响,主要表现为心肌纤维化,心室重构甚至可能会导致心力衰竭,主要原因可能是过量饱和脂肪酸（SFA）在心肌细胞中沉积。大量研究表明SFA可以在体外和在体内直接导致心肌脂毒性损伤,其机制主要包括炎症、内质网应激、自噬改变、氧化应激、基因表达和非编码RNA等。我们课题组前期通过高通量测序及实时定量PCR（q RT-PCR）发现miR-141-3p在高脂饮食诱导的肥胖大鼠心肌中和棕榈酸（Palmitate,PA）诱导的H9c2大鼠心肌细胞显著上调。目前关于miR-141-3p在PA诱导心肌脂毒性损伤中的作用尚未见报道。为了完善miR-141-3p调控PA诱导心肌脂毒性损伤的机制,我们通过生信预测,发现miR-141-3p与早老素1（Presenilin-1,PSEN1）存在特异性结合位点。那么miR-141-3p在PA诱导的心肌细胞中起什么作用,并且这种作用是否与PSEN1相关?目前还没有相关报道,基于以上问题开展了本次研究:（1）明确miR-141-3p在PA诱导心肌脂毒性损伤中的生物学功能;（2）解析miR-141-3p和PSEN1参与调控PA诱导心肌损伤的分子机制。研究方法:1、体外模型的构建,用400μM PA处理H9c2细胞不同时间（0,6,12,24,48h）后,应用油红O染色检测脂质沉积情况,应用LDH检测、CCK-8检测和流式细胞术来反应细胞损伤程度,应用q RT-PCR检测miR-141-3p的表达。2、上调或下调miR-141-3p表达后,分别用CCK-8、LDH、CK-MB、CTn-I试剂盒来观察在miR-141-3p对PA诱导心肌细胞损伤的作用。3、上调或下调miR-141-3p表达后,分别用流式细胞术、Hoechst 33258染色、JC-1染色和Western blot法检测凋亡相关蛋白表达量来观察在miR-141-3p对PA诱导心肌细胞凋亡的作用。4、利用双荧光素酶报告基因（luciferase assay）验证miR-141-3p是否直接靶向PSEN1。瞬转法转染miR-141-3p mimics和miR-141-3p inhibitor,通过Western blot法及q RT-PCR检测PSEN1在蛋白及m RNA水平上的表达量。5、上调或下调miR-141-3p后,通过Western blot法进一步检测PSEN1下游Notch1及AKT通路蛋白表达的变化。6、加入通路抑制剂后通过JC-1染色和Western blot检测观察miR-141-3p对PA诱导心肌细胞损伤作用的变化。结果:1、随着PA处理时间的增加,可明显增加心肌细胞脂质沉积情况,增加心肌酶的释放,抑制心肌细胞存活率,增加细胞凋亡。miR-141-3p的表达量也随时间的增加而增加。2、过表达miR-141-3p能够增加PA诱导的心肌细胞损伤,敲减miR-141-3p能够缓解PA诱导的心肌细胞损伤,由此推测,miR-141-3p在PA诱导心肌细胞损伤过程中起着促进作用。3、miR-141-3p上调能够促进PA刺激的心肌细胞凋亡,敲减miR-141-3p能够缓解PA刺激的心肌细胞凋亡,由此推测,miR-141-3p在PA诱导心肌细胞凋亡过程中起着促进作用。4、荧光素酶报告基因的结果显示miR-141-3p直接靶向PSEN1。miR-141-3p上调抑制PSEN1的表达,而敲减miR-141-3p后PSEN1表达量上调,说明miR-141-3p在PA诱导心肌细胞损伤过程中可能是通过靶向PSEN1起作用。5、Western blot检测结果表明,过表达miR-141-3p后抑制PSEN1蛋白表达,进一步抑制下游Notch1通路蛋白表达,而PTEN蛋白表达量增加,AKT通路蛋白表达减少。而敲减miR-141-3p后有相反的调节。说明miR-141-3p可能是通过靶向PSEN1/Notch1/PTEN/AKT轴在PA诱导的心肌细胞损伤模型中起作用。6、加入通路抑制剂（Notch1通路抑制剂DAPT,AKT通路阻断剂LY294002）后,减弱了miR-141-3p对凋亡的调控作用。说明miR-141-3p可能是通过靶向PSEN1/Notch1/PTEN/AKT轴调控PA诱导的心肌细胞凋亡。结论:1、在PA诱导H9c2大鼠心肌细胞中miR-141-3p上调,呈时间依赖性。2、miR-141-3p通过靶向PSEN1/Notch1/PTEN/AKT轴调控线粒体凋亡途径来调节PA诱导的心肌细胞凋亡。
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